阻断乙型肝炎病毒母婴宫内传播对血清病毒DNA和转录体影响的研究
作者：王清图 修霞 郭永 刘兰玉 牟莹莹 张伟 刘节 崔云
【关键词】 乙型肝炎病毒
【摘要】 目的 进一步探讨阻断乙型肝炎病毒（HBV）母婴垂直传播的效果，明确携带HBV生育期妇女干预对保护婴儿抗-HBV感染的意义。寻找乙型肝炎病毒转录体的检测在母婴传播诊断中的意义。 方法 224例HBsAg/HBeAg阳性孕妇分为两组，乙肝免疫球蛋白（HBIG）与左旋咪唑涂布剂治疗组154例，对照组70例。治疗组均在孕26周起开始阻断治疗。用酶联免疫吸附法（ELISA）检测孕妇和新生儿血清中的HBsAg等免疫学标记物，自母亲及其婴儿血清和母亲乳汁中提取核酸，经PCR及RT-PCR分别扩增HBV-DNA和RNA，琼脂糖凝胶电泳显示产物，Southern-blotting验证反应的特异性，取代表性产物克隆、测序，检测血清HBV-DNA及全长型（fRNA）和顿挫性转录体。 结果 治疗组和对照组新生儿外周血中HBsAg、HBV-DNA、fRNA和trRNA的阳性率分别为7.1%、3.3%、3.3%、47.5%和31.4%、6.7%、13.3%、70.0%，治疗组的前三项指标明显低于对照组（P<0.01），但后一项检测指标差异无显著性（P>0.05）。HBeAg（+）母亲的HBV-DNA（75%）和fRNA的表达（65%）显著高于HBeAg（-）的母亲（P<0.05）;所有表达fRNA的母亲也同时表达trRNA，在20例HBV-DNA（-）、fRNA（-）的母亲中，仍有8个可检测到trRNA。婴儿HBV-DNA（4.55%）和fRNA（6.81%）的表达较其母亲显著降低;占优势表达的是trRNA（52.27%），且与其母亲trRNA的表达状态密切相关。母亲为trRNA（+）的婴儿trRNA的表达显著高于母亲为trRNA（-）者。15例HBsAb（+）的婴儿均未检出HBV-DNA和fRNA，但11例仍可检测到trRNA。 结论 携带HBV孕妇于孕晚期给予HBIG和左旋咪唑涂布剂联合治疗后，婴儿HBsAg、HBV-DNA和fRNA携带率明显降低。然而，无论治疗组还是对照组，都有超过一半的患儿携带trRNA。与HBV-DNA及其表达产物相比，trRNA在HBV母婴垂直传播过程中有可能是一个出现更早期的可检测指标，它有助于更精确地确定新生儿HBV感染的状态。
关键词 孕期干预治疗 乙型肝炎病毒 宫内传播 左旋咪唑涂布剂 乙肝免疫球蛋白 病毒转录体
An observation on the vertical transmission of hepatitis B virus demonstrated by seroassays for viral transcripts，DNA and proteins
【Abstract】 Objective To further investigate the preventive effects on different intervention approaches on mother-infant vertical transmission of hepatitis B virus（HBV）.To investigate the charicteristics and clinical signifi-cance of HBV transcripts（the full length and truncated RNA molecules）in transmitting from mother to infant.Meth-ods 224cases of chronic HBsAg-carriers in pregnancy were divided into two groups.154cases received anti-HBV immunoglobulin injections and levamisole liniment since the26th week of gestation;70cases did not receive the treat-ment and were regarded as a reference group.HBV seromarkers，including HBsAg，HBsAb，HBeAg，HBeAb and HB-cAb，were examined by ELISA.The viral DNA and different types of transcripts in the sera were detected using PCR and RT-PCR，respectively.The serum viral nucleic acids extracted from pairs of mother and infant were analyzed us-ing PCR and RT-PCR targetted to the HBV X protein-encoding region.Reaction specificity was confirmed by Southern blotting.Representative amplification products were cloned and sequenced.Results The seropositivity rates for HBsAg，viral DNA and full-length and truncated transcripts in babies from the treatment and reference groups were7.1%，3.3%，3.3%，47.5%and31.4%，6.7%，13.3%，70.0%，respectively，with the first four parame-ters，rather than the last one，being significantly reduced in the former group than those in the latter.The expression of XDNA（75%）and fRNA（65%）in HBeAg（+）mothers was significantly higher than that in HBeAg（-）mothers（P<0.05）.All the mothers expressing fRNA expressed XDNA and trRNA at the same time.8mothers out of20were tr-RNA（+），who were both XDNA（-）and fRNA（-）.The detection rate of XDNA and fRNA in infants were signifi-cantly lower than that in their mothers，whereas the detection of trRNA was high（52.27%），which was expressed su-periorly in infants serum.Infants'trRNA expression was associated closely with their mothers'that infants from trRNA（+）mothers expressed trRNA higher than those whose mother were trRNA（-）.In15HBsAb（+）infants who were both XDNA（-）and fRNA（-），trRNA still can be detected in11cases.Conclusion The intervention therapy with immunoglobulin injections and levamisole liniment during pregnancy seems preventive on the vertical transmission of HBsAg，viral DNA and full-length transcripts，rather than that of the truncated viral transcripts.Compared with HBV DNA and HBV gene expressing products，trRNA might be a earlier detectable serum marker for identifying HBV infec-tion profile accurately in infants，which was associated closely with their mothers'expression of trRNA.
Key words preventive intervention hepatitis B virus vertical transmission levamisole liniment HBV im-munoglobulin viral transcript
孕妇携带的HBV可垂直传播感染胎儿。目前分娩时采取的一系列防范措施，尚不能完全阻止这种母婴垂直传播 ［1］ 。宫内感染是母婴传播的主要途径，是导致婴儿出生后乙肝疫苗（HBVac）接种失败的主要原因 ［2］ 。因此，阻断母婴传播是控制乙肝流行的关键环节。笔者使用HBVac、乙肝免疫球蛋白（HBIG）和左旋咪唑涂布剂（levamisole lini-ment）联合方案探讨阻断HBV宫内传播的临床疗效，取得了较好的效果。血清HBV表面抗原（HBsAg）/e抗原（HBeAg）阳性孕妇所生婴儿HBsAg阳性阻断率达80%以上 ［3］ 。然而，尚不知道这种干预能否完全保护婴儿免受感染，还是改变这种感染的类型 ［4］ 。最近建立起来的、能够识别不同3′端结构的HBV转录体血清学检测技术 ［5，6］ 为阐明这个问题提供了必要的手段。慢性乙型肝炎病毒感染者约1.3亿，其中有30%～50%通过母婴传播 ［7］ 。当孕母HBsAg阳性时，其新生儿80%～90%将感染HBV并成为慢性携带者 ［8］ 。母婴传播有三种途径，即宫内传播、产时传播及产后传播。大多数产后传播是由含HBV的母乳或唾液等体液中获得。
我国是HBV高流行区，人群HBsAg携带率很高，大约为10.0%～15.0% ［9］ ，其中大部分为成年人感染。妊娠合并HBV的感染率国内外报道不一，刘芙蓉等调查7170例孕妇结果显示HBV感染率高达55.58% ［10］ 。慢性乙型肝炎中30%～50%是通过母婴传播形成的 ［11］ ，而HBsAg（+）和HBeAg（+）的母亲是高危人群，其围产期传播率平均可达85.0%，这些婴儿如果不经免疫干预，大约有90.0%的婴儿今后将成为HBsAg携带者 ［12］ 。虽然新生儿免疫接种已经取得了巨大的成就，但仍有部分免疫失败;有些婴儿虽已产生抗体，但并不完全处于安全状态。由于现行HBV感染的诊断方法主要局限于检测HBV-DNA及其基因产物，在感染初期不易检测到，不能及时反映其HBV基因表达的状态，对其以后HBV感染状态的监测缺乏的依据。近年来对RNA的研究逐渐增多，Poon ［13］ 等报道从妊娠妇女的血液中可检测到完全相同的胎儿的RNA，有可能通过对血液中循环RNA的分析构建基因表达的理论模式，为从RNA水平研究母婴传播问题提供例证。HBV有4个阅读框，分别称为PreS2/PreS1/S、PreC/C、聚合酶和X基因，转录为3500个核苷酸的前基因组转录体和2400及700个核苷酸的亚基因组转录体，其中最小的转录体的翻译产物称为乙型肝炎X蛋白（hepatitis B x protein，HBx），与HCC发生有关 ［14～17］ 。在复制期间，所有上述病毒转录体利用同一个信号成熟，这一信号位于1789位上的UAUAAA结构区 ［18］ ，此研究中这一类HBV转录体称为全长型RNA（full-length RNA，fRNA）。然而，整合入染色体内的病毒DNA常有HBx 阅读框3′端丢失 ［19～20］ ，因而fRNA的产生受到影响，转录时HBx序列与下游的细胞序列融合，形成相应的嵌合转录体和病毒/细胞融合蛋白 ［21］ 。另一种病毒转录体还可以利用HBx阅读框内的一个CAUAAA结构区（1661位）成熟，称为顿挫型RNA（truncated RNA，trRNA）。TrRNA存在于HCC及其周围的肝实质细胞内 ［17］ ，编码的顿挫型蛋白可能保持有全长HBx的生长调控作用 ［22］ 。继Schutz等 ［23］人建立了从肝组织中检测上述两种转录体的方法后，Su和Zhang等 ［24，25］ 分别建立了从血清中定性和定量检测HBV-RNA的方法，其结果与肝组织进行的检测结果一致 ［19］ ，这一方法的建立使HBV-RNA的检测更简便易行。
本研究采用上述方法，检测母婴HBsAg、HBV-DNA、fRNA、trRNA，检测HBsAg（+）/HBeAg（+）母亲及其新生儿血清中的HBV-DNA和RNA，阻断乙型肝炎病毒（HBV）母婴垂直传播的效果，明确携带HBV生育期妇女干预治疗对保护婴儿抗-HBV感染的意义，探讨乙肝病毒转录体在母婴传播中的特点及意义，为监测其感染状态提供更科学的血清学指标，并为制定有效的阻断方法提供依据。自2003年1月开始，笔者对HBsAg阳性产妇及新生儿的血清进行检测HBsAg、HBV-DNA、fRNA、trRNA，现将结果报告如下。
1 对象与方法
1.1 观察对象 HBsAg/HBeAg阳性224例系2000年1月～2004年11月期间潍坊市妇幼保健院产科连续接诊的孕20周孕妇。经孕期干预，并住院分娩进行分组观察分析。224例孕妇孕期均无先兆流产史，无急性或慢性肝炎病史，无肝功能受损情况。孕妇年龄、孕产次、胎龄均差异无显著性。224例孕妇分娩新生儿224例，其中男114例，女110例。224例按患者意愿分为治疗组（n=154）和对照组（n=70）。观察新生儿与母亲外周血中免疫学指标、HBV-DNA以及检测不同类型病毒转录体的变化，评价上述干预措施的效果。观察血清乙肝病毒标志物即乙肝五项（HBV-M）包括HBsAg及其抗体（anti-HBs）、HBeAg及其抗体（anti-HBe）和核心抗体（anti-HBc）;检测的病毒转录体包括应用标准转录终止信号的全长型RNA（full-length RNA，fRNA）和隐匿终止信号的顿挫型RNA（truncated RNA，trRNA）。同时采集了治疗组44对母-婴的血清标本，母亲均为HBsAg（+），其中20例HBeAg（+）;婴儿中23男21女，差异无显著性（P>0.05）。High Pure Viral Nucleic Acid Kit，核糖体RNA（rRNA），Titan One Tube RT-PCR Kit，Digoxigenin-dUTP，Anti-Digoxigenin-AP，均购自Roche公司。Ex Taq酶购自宝生物工程有限公司。ELISA试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。
1.2 治疗方法 治疗组154例:孕26周开始治疗，孕妇接受HBIG（上海生物制品研究所生产，批号为20000712）臂大肌注射，200u/月，共4次;同时使用左旋咪唑涂布剂（福建省凯华药业有限公司，批号为20000307，500mg/支）5ml涂布于上、下肢体内侧皮肤易吸收处，每周2次至分娩。对照组70例:根据患者及其亲属的意愿未给予上述任何主动或被动免疫防治措施。新生儿乙肝疫苗接种均按第0、1、6月进行。
1.3 血清学检测 孕妇20～26周抽取肘静脉血2ml，新生儿分娩24h内采股静脉血2ml。分离血清，-50℃保存备用。乙肝五项检测采用ELISA法，按试剂盒（上海科华生物技术有限公司）说明进行。同时，按以前的方法［5，6］ 自血清中提取病毒核酸，每次提取用血清200μl，提取物终体积为50μl。按下述方法进行PCR及RT-PCR扩增。携带乙肝病毒的产妇在产后检查静脉血、新生儿血的HBV-M、HBV-DNA。我院检验科检测乙肝病毒，采用中山生物工程有限公司提供的乙肝病毒酶联免疫诊断试剂盒，用吸附法检测乙肝病毒标志物。检测HBV-DNA采用上海复兴医疗器械公司生产FX-2500基因扩增定量分析仪检测，阴性标准为每毫升HBV-DNA<1000拷贝。
1.4 病毒DNA的PCR扩增 上游引物为txs（1445）:5′-GGA CCG TGT GCA CTT CGC TT-3′，下游引物为txas（1574）:5′-CCT CAA GGT CGG TCG AC-3′。取2μl提取物，在含有引物对txs/txas的50μl反应体系中应用ExTag DNA聚合酶（Gibco BRL，Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD）按标准条件扩增35个循环。应用fRNA的cDNA质粒pMT9T40A（200pg）和trRNA的cDNA质粒pMT9T41A（200pg）作为阳性对照，用水作为阴性对照。
1.4.1 血清分离和核酸提取 孕妇26周采肘静脉血2ml，新生儿分娩后24h内采股静脉血2ml。血液采集后，30min内于40℃低温离心（4000r/m，20min）分离血清。核酸的提取采用High Pure Viral Nucleic Acid Kit，按照说明书操作，仅将其中的Poly（A）RNA替换为rRNA（ribosomal RNA）作为载体RNA，以免与后面使用的Oligod（T）引物结合而干扰HBV3′端的结构分析。200μl血清可得到50μl的核酸提取物。扩增产物10μl上样到含溴化乙锭（0.2μg/ml）的琼脂糖凝胶（2%）进行电泳，紫外线下观察结果，然后将产物转移到Hybond-N+膜（Amersham，Cat.No.RPN303B）上。紫外交联后，在杂交液（5×SSC，1%Blockingregent，0.02%SDS，0.1% Laurylsarkosing）中60℃孵育2～4h后，加入探针后60℃过 夜，用洗液洗4～6遍，加抗体，显色剂显色后终止。
1.4.2 探针制备 应用含有引物对txs1/xas1的PCR体系以BSX（含有HBV X片段的质粒）为模板，以地高辛（digox-in，Dig）标记的dUTP作为掺入物制备杂交探针，应用较低的掺入比（Dig-11-dUTP∶dTTP=1∶20）来证实反应产物的HBx区序列特异性。PCR条件为93℃1min40s;90℃40s;53℃50s;70℃40s;35个循环。
针对HBV基因X区血清核酸的PCR、RT-PCR及探针标记所用引物见表1。
1.5 fRNA和trRNA的RT-PCR检测 trRNA的RT-PCR系统采用半巢式PCR（semi-nested PCR），并在两次循环中均使用了锚定的Oligod（T）引物1683a- ［24］ ，分别与引物1445+和1464+配对，引物序列和位置见表1、图1。第一轮循环使用单管RT-PCR系统，按以前的方法 ［20］ 进行，反应体积为50μl，含模板RNA5μl，50℃20min，93℃1min40s，90℃40s;53℃50s;70℃40s;35个循环。第二轮PCR的反应体积50μl，含正反义引物各0.75μl（100ng/μl），模板cDNA5μl，条件为第一轮循环但不含逆转录过程。trRNA扩增用的锚定Oligod（T）引物与fRNA的末端1803～1806位置的结构也有一定的亲和力 ［26］ 。该trRNA RT-PCR系统既能识别trRNA，也能同时检测fRNA，反应条件同trRNA。为进一步显示反应的扩增效率和特异性，始终应用质粒DNA pMT9T40A和pMT9T41A进行平行扩增。前者为fRNA RT-PCR阳性而trRNA反应阴性;后者fRNA反应阴性而trRNA反应阳性 ［23］。此外用去离子水作阴性对照，始终参照Kwok和Higuchi提出的原则 ［26］ 避免实验室内污染。所有反应至少重复一次。
表1 针对HBV基因X区血清核酸的PCR、RT-PCR及探针标记所用引物（略）
图1 fRNA和trRNA的RT-PCR检测目的片段示意图（略）
1.6 逆转录后通过半巢式RT-PCR检测HBV-RNA3′端结构 我们以前的结果 ［5，6］ 表明，由于描定Oligo d（T）引物能够特异的扩增poly（A）RNA，检测病毒RNA的3′端结构的反应不需要Dnase I预处理标本;trRNA扩增用的Oligo d（T）引物与fRNA末端1803～1806位置的结构也有一定的亲和力，因此本研究用trRNA RT-PCR这一个反应同时显示trRNA和fRNA两种转录体分子，其产物大小分别为235bp和360bp ［9］ 。第一轮反应上游引物为txs;第二轮反应上游引物为txs2（1464）:5′-TCA CCT CTG CAC GTC GCA TG-3′;共用锚定引物为txas5（1683）:5′-（T） 15 GCT GG-3′。应用50μl单管RT-PCR系统（Roche，Mannheim，Germany）进行逆转录和扩增。为了表明血清中RNA的广泛存在和其分子的相对完整性，应用含有引物对GAPDH1/GAPDH2的RT-PCR体系对相同的标本中3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）RNA进行逆转录和扩增。所用上游引物为:GAPDH1（3755）:5′-CAT CTC TGC CCC CTC TGC TGA-3′;下游引物为:GAPDH2（4344）:5′-GGATGA CCTTGC CCA CAG CCT-3'。为了进一步显示反应的扩增效率及特异性，始终应用质粒DNA pMT9T40A和pMT9T41A进行平行扩增，前者为fRNA RT-PCR阳性而trRNA反应阴性;后者为fRNA反应阴性而trRNA反应阳性 ［5，6］ 。此外，去离子水和18S/22S核糖体RNA也被用来作为阴性对照，应用Kwok和Higuchi的方法 ［10］ 避免实验室内污染，并把所有的反应至少重复一次。
血清中病毒DNA的检测见图2所示为6对母婴血清的代表性检测数据。在20例HBsAg（+）、HBeAg（+）的母亲中15例检测到XDNA;24例HBsAg（+）、HBeAg（-）母亲，9例检测到XDNA。这两种不同血清免疫学标志母亲之间XDNA的表达差异有显著性（P<0.05），e抗原阳性的母亲的XDNA表达较高。在所有44个新生儿中共检测到2例XDNA阳性，他们分别来自HBsAg（+）、HBeAg（+）、XD-NA（+）和HBsAg（+）、HBeAg（-）、XDNA（-）的母亲。新生儿XDNA的表达与其母亲的XDNA的表达与否无直接相关性（P>0.05）。无论是表面抗原阳性还是e抗原阳性的母亲，其新生儿的XDNA表达都明显减弱，两组间差异无显著性（P>0.05）（见表2）。在4例HBsAg（+）的新生儿中，只有1例XDNA阳性。
表2 母婴血清免疫学标志、HBV-XDNA和转录体检测结果（略）
图2 母婴血清中HBx区核酸检测的代表性数据（略）
注:扩增产物经溴化乙锭染色（Eb）或Southern杂交（Hyb）显示;HBx区DNA（XDNA）、全长型（fRNA）、顿挫型（trRNA）病毒转录体分别为129bp，370bp，245bp;底部显示相应的血清学指标。A～F为母亲血清检测结果，a～f为相应婴儿的血清检测结果，G、H为阳性对照，I为阴性对照，M为DNA Marker 母亲A为HBV-DNA（+）、fRNA（+）、trRNA（+），其婴儿a为HBV-DNA（+）、fRNA（+）、trRNA（+）;母亲B、C为HBV-DNA（+）、fRNA（+）、trRNA（+），其婴儿b、c为单tr-RNA（+）;母亲D为HBV-DNA（+）、trRNA（+），其婴儿d为单trRNA（+）;母亲E为单trRNA（+），其婴儿e为单tr-RNA（+）;母亲F的HBV-DNA，全长型及顿挫型转录体均为阴性，其婴儿f为单trRNA（+）。
1.7 扩增产物的检测 把产物（15μl）上样到含溴化乙锭（0.2μg/ml）的琼脂糖凝胶（2%）进行电泳，紫外线下观察，分别用UVP凝胶分析系统和光学照相记录数据，用应用软件（LabWork3.0UVP）评价产物的强度。
1.8 统计学方法 按以前描述的方法 ［5，6］ 判定PCR和RT-PCR结果及其反应强度。计量资料采用t检验。数据使用SPSS9.0软件处理，均数资料采用χ 2 检验。
2 结果
2.1 组与非治疗组孕妇所生新生儿的血清免疫学指标 治疗组共154例。孕妇均接受HBIG注射3次以及左旋咪唑涂布剂治疗3个月，治疗过程中无不良反应，足月分娩。新生儿出生后48h内、接种乙肝疫苗前采集外周血进行HBV免疫学检测，其中新生儿HBsAg阳性11例（7.1%），anti-HBs阳性27例（17.5%）。对照组70例患者均足月妊娠分娩。新生儿娩出后48h内采集外周血送检，其中HBsAg阳性22例（31.4%），anti-HBs阳性11例（15.7%）。治疗组HBsAg阳性率显著低于对照组（P<0.01，表3）。治疗组anti-HBs阳性率与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。
表3 预防性干预对新生儿外周血HBV-M携带率的影响（略）
2.2 两组孕妇与新生儿血清中病毒转录体和DNA的检测治疗组母婴61对血清标本以及随机选取的30对对照组母婴标本进行了PCR和RT-PCR检测HBV转录体和DNA。结果见表4。
表4 预防性干预对母亲及新生儿外周血HBV-DNA、fRNA和trRNA携带率的影响（略）
对照组的30对观察对象中包括HBsAg和HBeAg阳性孕妇14例以及HBeAg已经转阴的孕妇16例。前14例中，病毒DNA强阳性者13例，fRNA强阳性者8例，trRNA阳性（+～++）13例;所生婴儿7男7女，HBsAg和HBeAg全呈阳性者4例，仅呈anti-HBc阳性者2例，HBV-M全阴性者1例，HBV-DNA阳性者1例，fRNA阳性者2例，但14例均呈trRNA阳性（+）。16例HBsAg/HBeAg阳性孕妇中，HBV-DNA阳性者5例，fRNA强阳性者2例，trRNA阳性（+～+++）者11例;所生婴儿10男6女，HBsAg阳性者2例，HBeAg/anti-HBc阳性者4例，HBV-DNA阳性1例，fRNA阳性者2例，trRNA阳性（+～++）者7例。综合本组30例新生儿的数据，HBV-DNA阳性者仅2例（6.7%），fRNA阳性者4例（13.3%），trRNA阳性者21例（70.0%）。其中2例病毒DNA阳性的新生儿血中也携带fRNA（+）和trRNA（++）。
治疗组61例HBsAg阳性孕妇中，HBeAg阳性者32例，HBeAg转阴者29例。在HBeAg阳性病例中，HBV-DNA强阳性者24例，fRNA阳性（++～+++）者22例，trRNA阳性（+～++）者22例;所生婴儿14男18女，HBsAg阳性合并病毒DNA阳性者2例，HBV抗体阳性者11例，fRNA弱阳性者2例，trRNA弱阳性者22例。在HBeAg转阴的29对观察对象中，母亲呈病毒DNA阳性者6例，fRNA阳性（+++）者7例，trRNA阳性（+～+++）者9例;所生14男15女均为HBsAg阴性，病毒DNA和fRNA亦均为阴性，其中anti-HBs阳性者3例，anti-HBc阳性者6例，trRNA阳性（+～+++）者7例。综合本组61例婴儿的血清学检测结果，HBsAg阳性合并HBV-DNA阳性者2例（3.3%），fR-NA弱阳性者2例（3.3%），trRNA阳性者达31例（50.8%）。2.3 fRNA和trRNA的检测 治疗组44对母婴血清标本结果如表2所示，fRNA在HBsAg（+）、HBeAg（+）母亲中的检出率为65%，在HBsAg（+）、HBeAg（-）母亲中为20.8%，HBeAg阳性母亲的fRNA表达较高，两者差异有显著性（P<0.005）。trRNA在HBsAg（+）、HBeAg（+）母亲中的检出率为70%，在HBsAg（+）、HBeAg（-）母亲中为58.3%，两者差异无显著性（P>0.05）。所有18例表达fRNA的母亲也同时表达XDNA和trRNA，母亲XDNA的表达与fRNA关系密切（P<0.005），与trRNA的表达无直接相关性（P>0.05）。在20例XDNA（-）、fRNA（-）的母亲中，仍有8例可检测到trRNA。在44名新生儿中，3例（6.82%）检测到fRNA，其中有2例HBV-DNA阳性，两者关系密切有显著性（P<0.05）;23例（52.27%）新生儿检测到trRNA。母亲XDNA、fRNA的存在状态与其新生儿相应指标之间均无直接相关性（P>0.05），见表5。但母婴之间trRNA的关系密切，母亲为trRNA（+）的婴儿trRNA的表达高于母亲为tr-RNA（-）者，差异有显著性（P<0.05），见表6。新生儿中trRNA（52.27%）的检出率明显高于fRNA（6.81%）和XDNA（4.55%），差异有显著性（P<0.005）。15例anti-HBs（+）的新生儿中检测到11例trRNA，均未检测到fRNA和HBV-DNA。
表5 母婴HBV-XDNA和转录体血清检测结果 （略）
表6 母婴trRNA血清检测结果 （略）
3 讨论
3.1 对HBsAg阳性孕妇行主动和被动免疫，可以有效降低宫内感染率 已有研究表明，乙肝免疫球蛋白对阻断乙肝病毒母婴传播有一定作用，孕妇产前多次注射HBIG能有效减少HBV的宫内感染 ［3］ 。左旋咪唑是一种非特异性免疫调节剂，主要作用于T细胞，诱导早期前T细胞分化成熟，成为功能性T细胞并可使功能失调的T细胞恢复正常，同时增强单核细胞的趋化作用和吞噬作用，激活巨噬细胞和粒细胞移动抑制因子，诱生内源性干扰素，提高免疫和病毒疗效，已经用于治疗慢性乙型肝炎 ［26～28］ 。本组资料中，单纯HBsAg阳性孕妇，对照组孕妇其新生儿外周血HBsAg阳性者占31.4%，而治疗组为7.1%，较前者显著降低，提示应用HBIG及左旋咪唑可明显降低HBsAg阳性的垂直传播。HBV母婴传播发生率与母体HBsAg的浓度以及是否有HBeAg有关，晚期妊娠时母亲携带较大量HBV病毒者容易传染给胎儿。有人提出HBV经胎盘感染胎儿的可能时间为孕中期或孕晚期 ［29］。由此我们认为，选择孕26周以后作为开始阻断HBV垂直传播的治疗时间较恰当。
在高流行区，HBV多数于围产期或幼儿期通过母-婴垂直传播，容易慢性化 ［30，31］ 。慢性感染早期是病毒高复制阶段，常为HBeAg阳性，血中有高水平的病毒DNA。随着血清HBeAg转阴，部分患者血中病毒DNA随之减少，感染进入低复制期，但仍然有一些患者血中有高滴度的病毒DNA，依然显示高复制状态，这种情况下发生肝癌的机会可能较大 ［32］ 。这种区别也可以通过fRNA量的变化反映出来，后者与病毒DNA的变化一致 ［5，6］ 。然而，HBeAg转阴后的上述两种情况下都可检测到trRNA，显示这种转录体的存在与病毒复制的关系不大［5，6］ 。我们的观察结果表明，在上述干预治疗过程中，母亲血中fRNA与DNA水平和HBeAg阳性密切相关，这证实了Su等的观察结果 ［4，5］ 。值得注意的是，婴儿血清HBsAg或fRNA阳性者其母亲血清多呈HBeAg、HBV-DNA和fRNA阳性。
3.2 尽管血清中HBsAg相对稳定，每年也有约1%～2%转阴 这是HBV慢性感染的更晚期阶段，称为隐匿性感染 ［4］ 。在某些病例，HBsAg转阴后一段时间内血液中仍存在anti-HBc ［31］ 。然而，大多数隐匿性感染的发生机制仍然是个谜 ［4］ 。而本资料中，无论在对照组还是在治疗组，母亲和婴儿血中trRNA阳性率都相当高（表4），甚至可能是HBV慢性感染的唯一标志，这也证实了苏勤等 ［5，6］ 提出trRNA的存在与否与上述病毒复制指标有明确相关性的结论。迄今为止，所有的HBV血清学指标中trRNA表现最稳定，适用于隐匿性HBV感染的诊断。我们的数据还提示，至少部分HBV隐匿性感染发生于围产期。是否母亲携带乙肝病毒者所生新生儿出生时检测RNA能早期发现HBV隐匿性感染 ［33～35］ ，并早做预防及治疗，有待深入观察。
3.3 HBV可经垂直传播引起感染 这一点已经得到大家的公认，而且垂直传播是HBV重要的传播途径之一，HBV垂直传播主要包括:（1）宫内感染:可能由于胎盘撕裂，母血漏入胎儿血液循环有关;（2）产程感染:指分娩时经产道，新生儿接触或吞入含HBV的血液、羊水或分泌物;（3）产后的密切接触及母乳喂养。有人估计，我国的慢性HBsAg携带者有40%～50%是母婴传播造成的。母亲HBsAg和抗-HBe可经胎盘传播，对婴儿HBV垂直传播的诊断应进一步动态观察HBsAg或查HBV-DNA，因为新生儿在7月龄时被动接受的HBsAg可全部转阴 ［18］ ，如果婴儿只是被动接受HBsAg和抗HBe，而并非HBV感染，那么婴儿肝炎通常能迅速消退，值得注意的是，如果婴儿感染的是HBV前C区突变株，虽然抗-HBe阳性，但预后较差，往往表现为慢性化，甚至出现肝硬化。婴儿出生后立即肌注乙型肝炎疫苗，可阻断通过产道及密切生活接触引起的垂直传播，但对于宫内感染的HBV则几乎无效。愈蕙等 ［36］ 为了探讨HBV感染接种乙肝疫苗失败原因，应用间接免疫荧光技术对其中32例宫内感染HBV的婴儿进行外周血T淋巴细胞亚群测定，结果CD4 + /CD8 + 值在宫内感染HBV接种乙肝疫苗无反应组最低，他们认为小儿宫内感染HBV对其免疫状态有一定影响，宫内感染HBV接种疫苗有无效果与小儿细胞免疫功能、免疫调控系统的作用是否正常有关 ［36］ 。HBV垂直传播不仅表现为母婴传播，而且还可以表现为父婴传播，如果婚前母亲接种乙型肝炎疫苗免疫成功，婴儿出生后约90%获得被动anti-HBs，而且能有效地避免HBV的父婴垂直传播。
3.4 我国是乙型肝炎病毒的高流行区，多数HBV感染是在围产期或者婴幼儿期通过母婴传播获得的 本研究从RNA水平初步探讨HBV母婴传播的，为明确母婴传播的机制提供新思路，为制定有效的阻断方法提供新的血清学指标。本研究结果显示XDNA在HBsAg（+）母亲中较高表达（54.55%），尤其是HBeAg（+）母亲，可达75%。HBV-DNA的表达和e抗原阳性有很好的一致性，这与既往的报道相符。但无论是表面抗原阳性还是e抗原阳性的母亲，HBV-DNA在其新生儿中的表达都明显减弱，两组间差异无显著性（P>0.05）。部分新生儿HBsAg（-）、HBsAb（+），但并不完全处于安全状态，或者由于病毒复制水平较低，或者由于病毒处于非复制状态，新生儿低表达的HBV-DNA不能很好地评价其HBV的感染状态。但此时HBV-DNA仍可以整合形式存在于肝组织内，并表达病毒转录体 ［37］ 。本研究结果表明新生儿中trRNA（52.27%）的检出率明显高于fRNA（6.81%）和XDNA（4.55%），差异有显著性（P<0.005）。提示与HBV-DNA及其表达产物相比，trRNA在HBV母婴垂直传播过程中有可能是一个出现更早期的可检测指标，它有助于更精确地确定新生儿HBV感染的状态。
3.5 免疫病理和分子生物学技术 在HBsAg（+）孕妇的流产死胎肝细胞中检测到HBV标志物，证实了宫内感染的存在。以往多数报道称宫内感染率在5%～10%。近来有学者应用免疫组化、核酸分子杂交检测胎心血HBsAg、anti-HBc IgM及胎肝组织的核心抗原（HBcAg）及HBV-DNA，证明宫内感染率可达20.0%～44.4% ［38］ 。通常出生时HB-sAg（+）的新生儿被认为已经发生了宫内感染，HBV-DNA的检测是最直接的证据，然而在本实验中HBsAg（+）的新生儿共4例，只有1例XDNA阳性。而trRNA在大多数（52.27%）HBsAg（+）母亲所产婴儿中表达。苏勤等 ［39］ 的研究指出，染色体内整合的HBV-DNA可能是trRNA的主要转录模板。如果用转录体来评价，那宫内感染率将大大增加。
RT-PCR/PCR的结果显示，在母亲和新生儿中，其fR-NA的存在分别与各自的XDNA的存在关系密切，而trRNA的存在不依赖于以上两者，结果与苏勤等 ［39］ 的研究结果基本一致。这进一步说明fRNA是病毒复制的指标，而trRNA标志着病毒持续感染状态。在母婴之间，XDNA与fRNA的存在缺乏直接相关性（P>0.05），即无论母亲是否表达XD-NA、fRNA，其婴儿均可表达相应的指标;而两者trRNA的关系密切（P<0.05），即母亲为trRNA（+）的婴儿trRNA的表达高于母亲为trRNA（-）婴儿。因此，无论是否在HBV感染的母血中检测到HBV-DNA或fRNA，都应采取积极的防治措施，尤其当母亲表达trRNA时。该结果是否说明母亲感染的整合型的HBV易于在婴儿中形成优势生长及trRNA状态是否能进一步引起HBV活动性改变有待后续动态研究证实。
Anti-HBs（+）婴儿通常被认为具有保护性，但事实上并不是一种完全的非感染状态。本实验结果显示15例anti-HBs（+）的新生儿中均未检测到fRNA和XDNA，但11例仍可检测到trRNA。此时trRNA可能是唯一能检测到的标志HBV感染状态的指标，为制定有效的防治措施和评价防治效果提供了新的血清学指标。但这种感染状态的意义及转归仍需进一步进行动态观察研究。
有人认为，染色体内整合的HBV-DNA可能是部分trRNA分子的转录模板 ［4～6］ 。我们观察到，应用HBIG及左旋咪唑可明显降低新生儿的HBsAg和病毒DNA的阳性率，但不能降低他们的trRNA携带率，与HBV-DNA及其表达产物相比，trRNA在HBV母婴垂直传播过程中有可能是一个出现更早期的可检测指标，它有助于更精确地确定新生儿HBV感染的状态。
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