脑缺血与神经细胞凋亡
【关键词】 脑缺血
细胞凋亡（apoptosis,APO），又称为程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD），是细胞受到生理或某些病理信号刺激后通过启动自身内部机制，主要是通过内源性核酸内切酶激活而发生的细胞死亡过程，是基因调控下的主动“细胞自杀”，在多种组织和器官发育的特定阶段及各种组织的生长调节和自身反应免疫细胞的清除中发挥重要作用［1～3］，许多研究表明神经细胞凋亡参与了缺血后的脑损伤。
1 脑缺血与神经细胞凋亡
许多研究表明，无论弥漫性脑缺血还是局灶性脑缺血均可引起神经元凋亡，其凋亡细胞的多少、发生部位与缺血时间、程度及神经元的敏感性有关［4］。
Macmanus［5］等首先报道了大鼠脑缺血后“半暗区”出现大量的凋亡细胞。储照虎［6］对大鼠局灶性脑缺血再灌注后观察，TUNEL凋亡细胞位于细胞核内，于再灌注30min时出现少量，位于纹状体水肿区周边；6h时基底节区水肿加剧，其间出现小梗死灶，凋亡细胞位于其边缘；24h时基底节区梗死灶扩大，边缘见大量凋亡细胞，皮层亦见凋亡细胞；72h时凋亡细胞位于基底节及皮层的梗死灶外缘。
Nitatori［7］等应用沙土鼠前脑缺血5min模型，缺血后第3天海马CAI区锥体细胞显示DNA片段，第4天凝胶电泳显示DNA梯，同时电镜观察发现核染色质凝集及凋亡小体；Sei［8］用沙土鼠前脑缺血10min模型，定量分析发现12h海马CAI区即可见DNA片段，48h达高峰，5天后仍可检测到，TUNEL显示DNA片段主要位于海马CAI区神经元内；Volpe［9］在大鼠弥漫性脑缺血的研究中，发现脑缺血后几小时在纹状体可检测到TUNEI标记阳性的神经元，而海马第3天可检测到，凝胶电泳DNA梯与TUNEL标记具有相同的时程关系，提示短暂前脑缺血后选择易损神经元的死亡伴有内切酶的激活，细胞凋亡参与了海马迟发性神经元死亡的发生。其他学者对大鼠弥漫性缺血的研究与以上结果基本一致［10，11］。
另外，脑缺血再灌注损伤后的神经细胞凋亡离不开基因的参与。因为细胞凋亡是细胞接受某种信号或受到某些因素刺激后产生的一种主动的，由一些凋亡相关基因相互作用的细胞消亡过程。某些基因如bcl、bax等参与细胞凋亡的调控过程，bax/bcl比值可决定细胞是否凋亡：bax高表达引起凋亡，bcl高表达则抑制凋亡。组织缺血后一段时间内，bcl表达下降，与细胞凋亡呈负相关［6～12］。刘富东［13］等利用实验观察，大鼠局灶性脑缺血2h再灌注30min后可见bcl-2蛋白阳性物质位于胞液，尤以核周细胞明显，该阳性细胞于再灌注6h时弥散于基底节及皮层，1天时数量减少，仅限于大脑皮层边缘局部，3天时近于无表达。
2 缺血后脑细胞发生凋亡的可能机制
缺血后脑细胞凋亡的发生机制，目前尚不清楚。研究显示可能与缺血再灌后神经细胞生存环境发生变化，包括兴奋性氨基酸、自由基、一氧化氮（NO）、Ca2+等，以及一些诱导凋亡的基因过度表达有关。细胞内钙超载在缺血性神经元凋亡的发生中起关键作用。钙超载及其所触发的一系列有害代谢是导致神经细胞死亡的“最后共同通路”。其激活某些钙离子依赖性蛋白酶参与神经元凋亡［14］。兴奋性氨基酸和氧自由基谷氨酸等氨基酸和自由基的毒性作用在再灌注损伤和迟发性神经元死亡起重要作用［15］。一方面谷氨酸受体介导的兴奋毒性作用可通过凋亡机制实现；另一方面，自由基在神经元凋亡中也起重要作用［16］。在脑缺血缺氧和再灌注条件下，神经元产生大量自由基、活化氧，遭受过氧化损害，造成线粒体质膜脂质过氧化，蛋白质硝化，损伤线粒体膜结构和链酶合物，同时造成线粒体损伤，使氧化磷酸化减弱或不能进行，ATP产生迅速减少，质膜钙泵失效，钙离子在线粒体大量积聚，触发进一步线粒体损伤而诱导神经元凋亡。此外，氧和葡萄糖供给减少引起能量下降还可直接诱导细胞凋亡［17］。
另外，细胞凋亡是细胞接受外来信号后发生的一种主动自杀过程，因此需要有新的基因表达。目前研究表明，许多基因如bcl-2、P53、cmyc等都与细胞凋亡有着密切的关系。bcl-2是凋亡的重要抑制基因之一，它的过度表达可抑制神经细胞发生凋亡［18，19］。正常的P53基因（野生型）对细胞凋亡有促进作用，突变的P53基因（突变型）对细胞凋亡具有抑制作用［20，21］。cmyc对细胞具有促进增殖及诱导凋亡的双重作用。这种相对对立的作用依赖于生长因子存在与否，当生长因子存在时，可抑制凋亡，促进增殖；反之则促进凋亡［22］。因此，脑缺血后细胞间液兴奋性氨基酸浓度升高，氧自由基大量产生，一氧化氮（NO）生成过多，细胞内Ca2+超载等因素相互交织，以及控制细胞凋亡的基因异常表达，是细胞凋亡发生的可能机制。
3 中药对缺血后脑细胞凋亡的影响
中药在缺血性中风有很好的疗效，近年研究比较多的黄芪、川芎及中药复方都具有神经细胞保护作用，并且影响缺血后脑细胞凋亡。李平等［23］以大鼠结扎双侧颈内动脉的方法复制脑缺血模型，采用免疫组化和流式细胞仪分别检测bcl-2、P53免疫阳性细胞和凋亡细胞。结果显示，结扎双侧颈内动脉后，脑局部血流下降，脑皮层促凋亡基因表达明显增强；通过腹腔注射黄芪注射液可抑制P53表达，增强bcl-2表达，越早应用则效果更明显，提示黄芪可以抑制缺血区促凋亡基因表达，增强抑制凋亡基因的表达。吕少平等［24］对实验大鼠于缺血前应用川芎嗪干预，然后用免疫组化法检测脑缺血再灌注不同时间内凋亡相关基因c-fos、bcl-2蛋白表达的变化，结果显示川芎嗪组大鼠脑缺血后的梗死体积显著减少，脑缺血再灌注时皮层和基底节区c-fos的表达明显下降，而bcl-2的表达明显增高，表明川芎嗪可抑制脑缺血再灌注时细胞凋亡的发生。而张博生［25］根据中医痰瘀同治理论，选用桂枝、茯苓、泽泻、丹皮、桃红、赤芍、川芎等药物对脑缺血模型细胞凋亡的影响研究，用大鼠夹闭双侧颈内动脉造成大脑缺血60min的动物模型。以免疫组化法检测bcl-2基因表达。结果发现其中药复方能明显增强缺血后脑皮层的bcl-2表达。提示其中药复方对实验性脑缺血的细胞凋亡过程有抑制作用。笔者要加强对中药单味或复方的研究，为缺血性脑血管病的治疗提供新的有效途径。
4 展望
研究表明凋亡是缺血损伤后脑细胞死亡的重要途径之一，尤其选择易损区的迟发神经元损伤的机制很可能就是凋亡。动物实验发现凋亡与坏死这两种细胞死亡类型对的反应截然不同，使用抗凋亡剂或采用相应对策可对神经细胞的损伤起到保护作用，这为缺血性脑损伤疾病的治疗开辟了新途径。因此，大力开展抗缺血损伤后神经凋亡药物的研究是今后研究的方向之一。抗缺血损伤后神经细胞凋亡的中医药研究刚刚起步，就目前资料看，已有对中药单体及其有效成分的研究，但未见有关根据中医理论而制定的中药复方的研究报道，加大力度开展中药对缺血损伤引起的神经细胞凋亡的研究具有重要意义。有关缺血再灌脑损伤造成神经细胞凋亡模型的制备，报道的方法较多，建立统一规范的动物模型是课题研究的关键。
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