脓毒症急性肺损伤大鼠肺组织的细胞凋亡
作者：徐笑益 方向明 鲍军明 石卓 顾伟忠
【关键词】 脱噬作用；脓毒症；肺损伤
[摘要] 目的 观察脓毒症急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织的细胞凋亡。方法 24只SPF级SD大鼠采用盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型，分别于CLP后0、12、36和72h颈椎脱臼法处死大鼠，取肺组织。行肺组织HE染色，观察病理变化，以透射电镜、TUNEL法检测细胞凋亡。结果 HE染色可见， CLP后12、36、72h肺泡间隔增宽，间质充血水肿，肺泡腔变窄，炎症细胞渗出。TUNEL法检测发现，CLP后12、36、72h肺组织内细胞凋亡指数（AI）增加，其中36hAI值最高（p<0.01）。透射电镜证实细胞凋亡的特征性改变。结论 脓毒症大鼠肺组织的AI明显增加，细胞凋亡可能在脓毒症ALI发生、中起着重要作用。
[关键词]：脱噬作用；脓毒症；肺损伤
[Abstract] Objective To investigate the pulmonary apoptosis of acute lung injury(ALI) in sepsis. Methods 24 S-D rats were performed cecal ligation and puncture(CLP) to induce sepsis. At the time of 0, 12, 36 and 72 hours after CLP, the rats were killed. Lungs were fixed for haematoxylin and eosin(H(E) stain. Apoptosis was determined by TUNEL test (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) and electron microscope. Results At 12, 36, 72 hours following CLP, interstitial edema occurred with massive infiltration of the inflammatory cell, and the pulmonary architecture was damaged. Electron microscope demonstrated characteristic findings of apoptosis. TUNEL test showed more positive cells at 12, 36, and 72 hrs compared with that at 0 hr. Conclusion Apoptosis may play an important role in the development of ALI.
【Key Words】apoptosis; sepsis; acute lung injury
脓毒症(sepsis, 又称全身性感染)是临床危重病患者主要的死亡原因之一，目前尚无脓毒症的有效方法。在美国每年有75万人发生脓毒症，其中有21万人死亡[1]，因此深入研究脓毒症的发病机制具有非常重要的意义。近年来国内外研究发现，细胞凋亡在脓毒症的发生、发展中起了重要的作用，淋巴细胞凋亡将导致免疫抑制，实质性脏器的细胞凋亡促进器官功能的损伤。本研究旨在观察脓毒症ALI大鼠肺组织的细胞凋亡及其在ALI发生发展中的作用。
材料和方法
1 实验动物 健康成年雄性SPF级SD大鼠24只，体重250-300g，由浙江省医学院动物中心提供。
2 模型的构建 3％硫喷妥钠腹腔注射麻醉，行盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症模型。参照Chaudry等[2]的方法，腹正中线切开2cm切口，在距离盲肠盲端1~2cm处以1号线结扎，用18号穿刺针在结扎处远端穿刺盲肠两次，为防止针孔闭合，将1/4长的18号穿刺针外套管贯通盲肠，并用1号线将外套管牢固固定于肠壁。盲肠还纳入腹腔，关腹。
3 标本采集和处理 分别于CLP后0h、12h、36h、72h颈椎脱臼法处死大鼠，立即将肺取出。
4 检测指标
（1）形态学观察 HE染色，光学显微镜下观察肺组织病理变化；醋酸铀－枸橼酸铅双重染色，TECNA10电镜观察细胞凋亡。
（2）末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL法） 肺组织以10％福尔马林固定6~24小时后，切成4μm厚的石蜡切片。石蜡切片按原位细胞凋亡试剂盒（试剂盒购自Roche公司，显色剂AP-red购自北京中山生物技术有限公司）提供的方法操作， 光学显微镜下观察并计数。
5 统计学分析 数据以均数±标准差（(((s）表示，用SPSS11.0软件对数据进行统计学分析处理。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）对数据进行比较，P<0.05为差异具有显著性意义。
结 果
1 病理组织学观察
肺组织HE染色可见CLP后12h肺泡间隔增宽, 炎症细胞渗出，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，肺泡腔狭窄。36、72h肺组织病改变加重，肺泡间隔明显充血、增宽，大量炎症细胞渗出，肺泡腔明显狭窄，有时可见肺实变。
2透射电镜
TECNA10电镜下可见CLP后12、36、72h凋亡细胞染色质浓集，边聚，核固缩，胞膜完整，有时可见凋亡小体，肺泡上皮细胞板层小体排空现象增多，出现大量空泡。
3 TUNEL检测结果
光学显微镜下观察，凋亡阳性细胞核呈红色着染。同一切片随机取5个高倍镜视野(×400)，细胞中平均阳性细胞的凋亡指数（Apoptosis Index，AI）[3]。可见CLP后12、36、72h AI均比0h高（P<0.01），其中36h的AI最高，随CLP时间延长AI呈先增加后降低的趋势。不同时间点肺组织的AI见表1。凋亡细胞包括肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞、血管内皮细胞和淋巴细胞等炎症细胞。表1：大鼠CLP后肺组织内AI的比较注：各时间点与0h比较：* P<0.01
讨 论
脓毒症是引起ALI最常见的病因，利用盲肠结扎穿孔复制脓毒症自70年代起就已应用于动物实验研究中，这一模型与临床上常见的肠穿孔引起的腹膜炎较为接近，有较高的研究价值，其发生、的机理主要是腹腔内病原微生物入侵、感染后，机体过度产生炎性分子，使肺组织中的上皮细胞、血管内皮细胞等细胞间粘附分子表达上调 [4,5]。本研究通过CLP复制脓毒症模型，发现CLP后12～72h各时点大鼠肺组织均呈现肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润，毛细血管扩张、出血，肺泡结构破坏等病理改变，随时间延长病变程度加重，表明ALI的模型复制成功。
本实验通过透射电镜发现CLP12～72h后肺组织内发生细胞凋亡，通过TUNEL法定量观察到12～72h各时间点AI明显增加，凋亡细胞包括支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞等炎症细胞。脓毒症最重要的并发症（后续症）是器官功能障碍，细胞凋亡在脓毒症ALI中的作用可能有，肺泡上皮细胞和血管内皮细胞凋亡导致血管壁和肺泡壁通透性增高，渗出增加，引起肺泡弥散功能下降，大量淋巴细胞凋亡导致机体免疫功能紊乱，影响了促炎抗炎反应的平衡，共刺激分子表达能力下降，细胞免疫功能下降[6]。
本实验中还发现CLP后12～72h肺组织内AI呈先增加后降低的趋势，可能因为随着CLP时间延长部分细胞发生坏死，同时大量凋亡细胞被吞噬细胞清除，细胞凋亡是一个动态发展的过程。
综上所述，脓毒症时肺组织内大量细胞发生凋亡，调控细胞凋亡将有助于脓毒症器官功能损伤的防治。
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