人类冻融胚胎移植技术的临床应用

             作者：王晓红，罗亚宁，李丽，杨艳红，闫凯麟，黄剑磊，闵保华

【关键词】  冻融

    Clinical application of transferring cryopreserved human embryos

　　【Abstract】 AIM: To study the clinical application of transferring frozenthawed embryos and to analyze the factors influencing the outcome of frozenthawed embryos transfer (FET). METHODS:  Eighty FET cycles in 63 cases from September 2003 to December 2004 were analyzed retrospectively. The suppernumberary embryos obtained from in vitro fertilization (IVF) or intracytoplasmic sperm injection (ICSI) were cryopreserved by slow freezing and rapid thawing method. RESULTS:  Two hundred and sixtynine out of the 392 thawed embryos survived, with an embryo survival rate of 68.62%. The pregnancy rate was 23.75% per FET cycle. The pregnancy rate was significantly higher in the group of transferring 3 embryos than that of transferring ≤2 embryos（30.91% vs 8%, P<0.05）. There was significant difference between the conceived and nonconceived cycles in term of the rate of cleavage integrality and the percentage of quality embryos （67.28% vs 60.09%, 89.09% vs 73.55%, respectively P<0.025）. CONCLUSIONS:  The number and quality of frozenthawed embryos transferred are the most important factors influencing the pregnancy rate after frozenthawed embryo transfer.

　　【Keywords】 frozenthawed; embryo cryopreservation; embryo transfer; pregnancy rate

　　【摘要】  目的： 研究冻融胚胎移植的临床应用及分析影响冻融胚胎移植妊娠率的相关因素. 方法： 对63例80个冻融胚胎移植周期进行回顾性分析，通过IVF或ICSI获得的剩余胚胎采用慢速法冷冻保存，快速法解冻复苏. 结果： 解冻392个胚胎，成活269个胚胎，胚胎复苏率为68.62%. 周期临床妊娠率为23.75%. 每周期植入3个胚胎组的临床妊娠率显著高于植入≤2个胚胎组（χ2=4.98, P<0.05）. 妊娠周期胚胎细胞完整率及优质胚胎率显著高于非妊娠周期（67.28% vs 60.09%, 89.09% vs 73.55%，均为P<0.025）. 结论： 冻融胚胎移植的成功率与移植胚胎的数量和质量密切相关.

　　【关键词】 冻融；冷冻胚胎；胚胎移植；妊娠率

　　0引言

　　胚胎冷冻技术是将胚胎放入冷冻保护剂中，在超低温环境中保存，需要时再将胚胎解冻复苏的技术，它是“试管婴儿”即体外受精―胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVFET）技术的一项重要衍生技术. 在本生殖医学中心200309/200412间共接受IVF或单精子卵母细胞质内显微注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）技术助孕的不孕症患者63例，80个冻融胚胎移植治疗周期，80个冻融胚胎移植治疗周期中来自IVF 71个周期， ICSI 9个周期，报道如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　冷冻胚胎来源： 促超排卵、取卵、体外受精及胚胎培养，均按本中心操作常规进行，于取卵术后48~72 h将2~3个新鲜胚胎移植入子宫腔. 剩余的存活胚胎（Fig 1A），采用慢速法冷冻保存，快速法解冻复苏［1］.

　　1.2方法

　　1.2.1胚胎冷冻冷冻液CryoPBS： 含25 g/L人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS+25 g/L HAS）； FS1: 1.5 mol/L丙二醇+CryoPBS; FS2: 1.5 mol/L丙二醇+0.1 mol/L蔗糖+CryoPBS. 冷冻液及解冻液均来自瑞典Vitrolife公司.  在四孔培养皿1, 2, 3, 4号孔中分别加入1 mL CryoPBS, FS1, FS2, FS2，室温平衡. 将胚胎放入CryoPBS 2~5 min后，放入FS1保持10 min，再将胚胎放入FS2后装入麦管并封口. 将麦管放入冷冻仪（Planer Kryo3601.7，英国）开始冷冻程序：从18℃起，以2℃/min逐渐降温至-7℃，此时用液氮浸透的棉签在麦管接近棉塞的部位进行植冰（seeding），然后以0.3℃/min缓慢降温到-30℃,再快速降温至-100℃程序结束，迅速取出麦管，放入液氮罐（-196℃）保存.

　　1.2.2胚胎解冻解冻液TS1: 1.0 mol/L丙二醇+0.2 mol/L蔗糖+CryoPBS; TS2: 0.5 mol/L丙二醇+0.2 mol/L蔗糖+CryoPBS; TS3: 0.2 mol/L蔗糖+CryoPBS. 将解冻液TS1, TS2, TS3及CryoPBS分别按顺序加入四孔培养皿中，从液氮罐中拿出麦管，室温下解冻30 s后，放进30℃水浴中30 s. 剪去一端或拔掉塞子，接上麦管操作器，然后再剪去另一端，小心地将胚胎吹入TS1中，在TS1中孵育5 min，移入TS2 5 min，再移入TS3中5~10 min，将胚胎放进CryoPBS， 37℃下保持10 min. 最后将胚胎放入培养液中培养2~12 h，检查胚胎存活率并记录胚胎形态，有半数以上的分裂球存活的胚胎可以移植（Fig 1B）.
 
　　1.2.3冻融胚胎移植（FET）时机选择① 周期（natural cycles）： 月经有排卵的患者一般选择在自然周期进行FET. 在预计排卵日前3~4 d行黄体生成素（LH）测定，同时B超监测卵泡发育和排卵，排卵后2~3 d或LH峰出现4 d后行FET.② 激素替代周期（hormone replace treatment）： 雌激素水平低下的无排卵的患者在激素替代周期内进行FET. 从月经周期或撤退性出血的第2~3日起，戊酸雌二醇2~8 mg/d, po, 10~14 d后B超监测子宫内膜厚度，当子宫内膜厚度≥8 mm时，开始加用黄体酮60~100 mg/d，给予黄体酮4 d后，解冻胚胎并FET. ③ 促排卵周期（ovary stimulation cycles）： 月经稀发或月经不规律的患者，可给予克罗米芬（CC）或人绝经尿促性腺激素（HMG）促排卵治疗，阴道B超监测卵泡发育，当主导卵泡直径≥18 mm时给予hCG 5~10 kU, im. 排卵后2~3 d或注射HCG后84 h行FET.

　　1.2.4妊娠监测于移植后15 d查尿或血HCG，若阳性则于停经7 wk行B超检查，见孕囊及原始心管搏动诊断为临床妊娠，继续随访至妊娠结束.

　　统计学处理： 年龄、不孕时间、移植胚胎数等定量资料以x±s表示；对计数资料进行χ2检验；用SPSS12.0软件进行多因素Logistic回归分析.

　　2结果

　　2.1一般概况与结局80个FET周期，年龄23~36(31.4±3.0)岁，不孕时间1~15(6.3±3.1) a. 解冻胚胎392个，复苏胚胎269个，胚胎复苏率为68.62%. 每周期移植胚胎数1~3(2.6±0.6)个. 19例临床妊娠，临床妊娠率23.75%（19/80）；流产4例，流产率21.05%（4/19）；多胎5例（均为双胎），多胎率26.32%（5/19）. 已分娩6例，出生婴儿8（男5，女3）名，体质量(2523.8±497.7)g，随访至200412均发育正常，身体健康. 9例继续妊娠中.
 
　　2.2年龄与临床妊娠率的关系将病历资料划分为2个年龄段，比较临床妊娠率，两组间无显著性差异（χ2=0.84, P>0.05），<30岁组19个周期，临床妊娠6例，临床妊娠率31.58%；30~36岁组61个周期，临床妊娠13例，周期临床妊娠率21.31%.

　　2.3不同体外受精方式及不同移植周期类型与临床妊娠率的关系将病历资料按不同的体外受精方式划分为IVF组和ICSI组，比较临床妊娠率，两组间无显著性差异（χ2=0.01, P>0.05），IVF组71个周期，临床妊娠17例，周期临床妊娠率23.94%；ICSI组9个周期，临床妊娠2例，周期临床妊娠率22.22%.  不同类型周期的临床妊娠率三组间无显著性差异（χ2=0.16, P>0.05, Tab 1）.

　　2.4移植胚胎数目与临床妊娠率的关系每周期植入3个胚胎组55个周期，临床妊娠17例，周期临床妊娠率30.91%；每周期植入≤2个胚胎组25个周期，临床妊娠2例，周期临床妊娠率8%. 每周期植入3个胚胎组的临床妊娠率显著高于植入≤2个胚胎组（χ2=4.98, P<0.05）.表1不同类型移植周期的临床结局（略）

　　2.5影响FET结局的多因素Logistic回归分析将可能影响FET结局的因素： 年龄、不孕时间、受精方式、移植周期类型、移植胚胎数目，进行多因素Logistic回归分析. 结果显示：移植胚胎数目对FET结局有很大影响，多移植1个冻融胚胎，可使妊娠成功的机率增加约7倍（P=0.017, OR=6.953）；不孕时间对FET结局也有影响，不孕时间每增加1 a，妊娠成功的机率减少约30%（P=0.010, OR=0.722）.

　　2.6妊娠周期与非妊娠周期的比较妊娠周期胚胎复苏率（复苏胚胎个数/解冻胚胎个数×100%）与非妊娠周期无显著性差异（χ2=3.19, P>0.05）；妊娠周期细胞完整率（复苏后胚胎细胞总数/冷冻时胚胎细胞总数×100%）显著高于非妊娠周期（χ2=6.21, P<0.025）；妊娠周期优质胚胎率（Ⅰ级和Ⅱ级胚胎总个数/移植胚胎总个数×100%）显著高于非妊娠周期（χ2=5.65, P<0.025, Tab 2）. 表2妊娠周期与非妊娠周期的比较（略）

　　3讨论
 
　　本研究中冻融胚胎移植的周期临床妊娠率为23.75%，与Karltrom等［2］和Oehninger等［3］22%~25%的研究结果相似.     有研究显示与常规IVF技术的冻融胚胎移植相比，ICSI治疗后的冻融胚胎移临床妊娠率显著下降，但也有报道认为两者无显著性差异［4］. 本结果显示ICSI技术并未影响冻融胚胎的种植潜能. 由于本研究ICSI例数较少，尚需更大样本的研究加以证实.

    关于冻融胚胎移植时机的选择目前的研究尚无一致的结论. 本结果显示采用不同类型周期移植冻融胚胎，其成功率无明显差异. 我们认为，针对不同的患者，采用不同的方案，实现个体化，尽量使子宫内膜与胚胎发育同步，提高子宫内膜的容受性，以获得较高的妊娠率. 鉴于周期符合生理、简便、，我们认为有排卵者尽量采用自然周期为宜.

　　多数研究认同在冻融胚胎移植的治疗中，年龄是影响妊娠率的重要因素，尤其是35岁以上，生育力明显下降. 其原因主要是卵巢功能减退，卵子质量及子宫内膜的容受性下降以及遗传异常影响受精和妊娠的维持. 本研究显示： <30岁组和30~36岁组，周期临床妊娠率虽未证实有统计学差异，但仍能显示出妊娠率随年龄增高而下降的趋势；妊娠结局与不孕时间有显著的负相关性，随不孕时间延长，患者年龄增加，妊娠率降低，所以不孕症患者及早治疗是非常重要的.

　　冻融胚胎移植的妊娠率与移植胚胎的数量［5］和质量［6］密切相关. 本结果显示，每周期植入3个胚胎组的临床妊娠率明显高于移植≤2个胚胎组. 多因素回归分析研究也显示，妊娠结局与移植胚胎数目有显著的正相关性. 此外，妊娠周期的细胞完整率及优质胚胎率均高于非妊娠周期，提示冻融胚胎的质量可能会影响妊娠率. 我们推测细胞完整率更为直接地反映了胚胎对解冻过程的耐受情况，可成为预测妊娠结局的一个指标.

　　【】

　　［1］  Testart J, Lassalle B,  BelaischAllartg. High pregnancy rate after early human freezing ［J］. Fertile Steril, 1986；46(2): 268-272.

　　［2］  Kaltrom PO, Bergh T, Fosberg AS, et al. Prognostic factor for success rate of embryo freezing ［J］. Hum Reprod, 1997； 12(6): 1263-1266.

　　［3］  Oehninger S, Mayer J, Muasher S. Impact of different clinical variables on pregnancy outcome following embryo cryopreservation ［J］. Mol Cell Endocrinol, 2000;169(12): 73-77.

　　［4］  Check ML, Check JH, SummersChase D. Pregnancy/implantation rate as related to age following transfer of frozen embryo produced by ICSI ［J］. Arch Androl, 2001;47(3): 161-165.

　　［5］  Loh SK,  Leong NK. Factors affecting success in an embryo cryopreservation programme ［J］. Ann Acad Med Singapore, 1999;28(2): 260-265.

　　［6］  Schalkoff ME, Oskowitz SP, Powers RD. A multifactorial analysis of the pregnancy outcome in a successful embryo cryopreservation program ［J］. Fertil Steril, 1993;59(6):1070-1074.