检测尿微量蛋白和Ⅳ型胶原对糖尿病肾病早期诊断的意义
［关键词］ 糖尿病肾病；视黄醇结合蛋白；转铁蛋白；Ⅳ型胶原
糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)为糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的一种严重慢性并发症，在糖尿患者的死亡原因中占有较大比例，故早期诊断对DM的防治和预后具有重要意义。在早期肾活检发现组织学改变时，临床上常无症状，尿常规与肾功能检查均可正常。目前肾病的实验室诊断多以尿微量蛋白、肌酐等作为主要诊断指标，这些指标也难以发现肾脏的早期损害。本资料联合检测尿中视黄醇结合蛋白(R?binding protein,RBP)、转铁蛋白(Transferrin,TRF)等微量蛋白和Ⅳ型胶原(Type Ⅳ collagen,Ⅳ?C)，以期早期发现肾脏损害，进而有助于筛选及检出早期DN。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 正常对照组 50例，为健康体检人群，男28例，女22例，平均年龄(35.2±10.8)岁。
1.1.2 糖尿病组 按WHO标准诊断：空腹血糖≥7.8 mmol/L或2 h血 糖≥11.1 mmol/L纳入本研究。共50例，其中男性26例，女性24例，平均年龄(54.2±13.5)岁，以上病例均无其他原因引起的泌尿系统病变及近期服用肾毒性药物史。根据DM患者尿微量白蛋白排泄率(Urinaryalbumin excretionrate,UAER)将其分为3组。DM1组：UAER＜30 mg/24 h，为无肾病组共15例。DM2组：UAER在30 mm/24 h～300 mg/24 h，为初期肾病组共 17例。DM3组：UAER＞300 mg/24 h，为临床肾病组共18例。
1.2 方法
1.2.1 尿微量白蛋白(mALB)肌酐测定 免疫比浊法测定mALB,试剂由伊利康生物制品公司提供。同时用Beckman cX7全自动生化分析仪测量尿肌酐，试剂由美国贝克曼公司提供。结果以 mALB/Cr表示，单位为mg/mmol。
1.2.2 尿RBP、TRF测定 留取除晨尿外的尿液，离心收集上清液，根据磺基水杨酸尿蛋白定量结果进行不同倍数的稀释。采用ELISA法，按福建太阳生物技术公司提供的试剂盒说明书进行测定，结果分别以RBP/Cr、TRF/Cr表示，单位为mg/mmol。
1.2.3 尿Ⅳ?C测定 由于Ⅳ?C在尿中浓度较低，需对标本进行浓缩。其操作为在离心后的尿液标本中缓慢 依次加入SigmaChemical CO，出品的10 g/L牛γ?球蛋白0.8 ml和5 ml的450 g/L的PEG?4000，在4°C孵育5 min后，于冷冻离心机离心，弃上清液，再用生理盐水充分溶解至1 ml，即得到10倍浓缩尿标本。将浓缩后的尿标本采用ELISA法，按院上海细胞生物研究所施高生物技术实业有限公司生产的Ⅳ?C测定试剂盒说明书进行测定，单位为ng/ml。
1.3 数据统计 实验数据以±s表示，以单因素方差分析进行数据处理，部分指标进行相关分析，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
正常对照组与DM各组间尿中mALB、RBP、TRF及Ⅳ?C含量的比较见表1。在正常对照组、糖尿病无肾病组、初期肾病组及临床肾病组中其尿中的mALB、RBP、TRF及Ⅳ?C含量均呈递增趋势。其中在无肾病组(DM1)其mALB含量与正常对照组差异无显著性(P＞0.05)，而RBP、TRF及Ⅳ?C含量均已高于正常对照组(P＜0.05)。在初期肾病组(DM2)尿中mALB、RBP、TRF及Ⅳ?C4种微量蛋白的含量与正常对照组相比均有显著升高(P＜0.01)，且高于无肾病组(P＜0.05)。在临床肾病组(DM3)尿中上述4种微量蛋白的含量与对照组、无肾病组及初期肾病组相比，均呈显著性升高，其中增加的倍数以mALB为最。
表1 正常对照组与糖尿病各组间尿微蛋白检测结果比较（略）
注：与正常组相比*P＜0.05,**P＜0.01
3 讨论
DM患者并发DN的死亡率为未并发肾病者的30倍，一旦发生临床DN，则缺乏有效方法制止其，故早期诊断对DN的防治和预后尤为重要。由于早期肾脏病有关症状不多，在少量蛋白尿时也不易被注意，因此大多DN患者总在有明显蛋白尿时方被察觉。认为mALB检测对DN的早期诊断具有价值，在糖尿病患者的尿常规检查中，一旦出现持续阳性，DN的发展将无法逆转［1］。现已有人将RBP、TRF、mALB及N?乙酰?β?D氨基葡萄糖苷酶合称为尿系列蛋白［2］，认为他们对DN的早期诊断有重要价值。RBP是一种分子量为 21.2×103 U的低分子量蛋白，经肾小球滤出后，在近端小管几乎完全被重吸收。RBP本身具有较好的稳定性，产量相对恒定，故其在尿中的排泄量可作为肾小管功能受损的一个灵敏指标。实验结果显示，在糖尿病无肾病组中，其mALB含量与对照组相近，而RBP含量已增高，且与对照组存在显著差异。这说明DM患者尿中白蛋白含量尚未增加之前，RBP的含量已明显升高。并可进一步说明，在DM的早期尚未发生肾小球功能障碍时，已存在肾小管的功能损伤［3］。TRF分子较白蛋白稍大，但所带负电荷较少,负电荷越少，就越易通过肾小球的负电荷屏障碍。因此当DM患者的肾小球滤过膜上出现电荷改变时，TRF较白蛋白更易从肾小球滤过，尿中TRF排泄量的增加较白蛋白排泄量的增加出现更早。实验的DM1组中，在mALB与对照组相近的情况下，TRF的含量已呈增高趋势，这说明TRF可作为诊断DM早期肾脏病变的一项敏感指标。Ⅳ?C为细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)的主要成分，是构成基底膜骨架的主要胶原成分。因其在尿中的含量很低，故采用PEG?4000沉淀大分子蛋白的方法［4］，对尿标本进行浓缩后检测，结果显示在DM1组，Ⅳ?C同样出现增高趋势。这说明在肾小球基底膜功能损害较轻，尿中mALB含量尚正常时，已出现了Ⅳ?C的增加。DM患者尿中Ⅳ?C，随肾病加重而增加，说明其可以作为DN发展的指标。近年来Kotajima等［5］利用一种高度敏感且无需浓缩尿的方法，并通过加入Tris?缓冲液除去沉淀等干扰物，对尿中Ⅳ?C进行测定。其研究表明，当DM患者尿中mALB尚在正常范围时，尿中Ⅳ?C含量已有明显升高，同时伴有糖化血红蛋白水平的升高，这些结果均显示尿Ⅳ?C为有用的DN早期标志物。总之，联合检测尿中RBP、TRF等微量蛋白和Ⅳ?C的含量可监测DN的发生和发展，为发现早期DN有意义的临床指。
：
［1］ Parving h H, Andersen A R, Smibt U M, et al. Effect of antihypertensive treatment on kidney function in diabetic nephropathy［J］. br Med J,1987,294(6):1443?1447.
［2］ 陈海英，沈稚舟Ⅱ型糖尿病患者微量白蛋白尿的影响因素［J］实验诊断杂志，1998，2(1)：18?21.
［3］ Hong c Y, Chia K S. Markers of diabetic nephropathy［J］. j Diabetes Complications,1998,12(1)：43?46.
［4］ Banu n, Hara H, Katacka S, et al. A novel method for con?centrating urinary type Ⅳcollagen based on precipitation with polyethylene glycol: Application to its measurement by enzyme immunoassay［J］. ann Clin Biochem,1994,31(Pt 5): 485?491.
［5］ Kotajima n, Fukumura Y, Obata S U, et al. The significance of determination of urinary type Ⅳ collagen concentrations from a random urine collection in patients with non?insulin dependent diabetes mellitus［J］. rinsho Byori,1998,46(3):277?282.
