时间分辨荧光免疫技术在乙肝病毒标志物定量检测中的临床应用
［关键词］ 乙肝病毒标志物；时间分辨荧光免疫技术；临床应用
我国为乙肝病毒(HBV)感染高发区，约有1亿人为乙肝表面抗原携带者。HBV感染后血清学检测组合的标志模式多且复杂，临床常用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行乙肝病毒标志物(HBV?M)的检测和用聚合酶链反应(PCR)法进行HBV?DNA的检测来判断HBV的感染或疗效。由于ELISA法简单、方便、快速的优点在临床得到广泛应用，但受方法学本身的限制，它不能提供HBV?M的具体含量，只能作为阴阳性判断，故不可能完成HBV感染的动力学观察。用PCR法进行HBV?DNA的检测由于受到各种因数的影响，不能在临床上广泛使用，而时间分辨荧光免疫技术(TRFIA)的出现提供了对HBV?M进行定量检测的手段。TRFIA法具有灵敏度高、重复性好、特异性强、定量范围宽等优点［1，2］。作者采用TRFIA法对720份血清标本进行HBV?M检测，并对结果进行了分析。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源 本院门诊和住院部的720例患者，男435例，女285例，年龄3岁～78岁。清晨空腹静脉取血3 ml送检。
1.2 肝炎病毒血清学标志物检测 720例患者均以采用TRFIA法检测血清HBV?M(HBsAg、抗?HBs、HBeAg、抗?HBe、抗?HBc)，TRFIA检测仪泰莱?1及配套试剂由广州丰华生物工程有限公司提供。阳性标准为：HBsAg≥0.2 ng／ml；抗?HBsAg≥10 mIU／ml；HBeAg≥0.03 Ncu／ml；抗?HBe≥2.00 Ncu／ml；抗?HBc≥0.1 Ncu／ml。操作步骤严格按说明书进行。对可疑结果：如低浓度阳性结果，HBsAg和抗?HBs或HBeAg和抗?HBe同时阳性的均进行双孔复查。
1.3 统计与分析 抗原抗体排列顺序：HBsAg；抗?HBs；HBeAg；抗?HBe；抗?HBc。以阳性项目的序号代表该阳性项，同一患者血清HBVM组合称抗原抗体模式(如1+3+5代表HBsAg，HBeAg，抗?HBc同时阳性)，按抗原抗体模式统计分析。
2 结果
2.1 抗原抗体模式 实验中共检出13种抗原抗体模式，HBsAg阳性的模式共6种，533例，HBsAg检出率为74.03％，且在5 ng／ml及以下HBsAg检出率为8.75％(63／720)；其中1+3+5模式167例占23.19％；1+4+5模式313例占43.37％；1+5模式21例占2.92％；1+3模式18例占2.5％；1+4模式9例占1.25％；1模式5例占0.69％。HBsAg阴性的模式共6种，164例占病例总数的22.78%；其中2模式23例占3.19％；4+5模式15例占2.08%，2+4+5模式16例占2.22％；2+5模式39例占5.42％；5模式18例占2.5%，2+4模式53例占7.36％。抗原抗体全阴性23例占3.19％。
2.2 HBVM浓度 在1+3+5模式中HBsAg、HBeAg、抗?HBc的浓度分别为：(215.38±98.76) ng／ml、(1.15±0.82) Ncu／ml、(12.32±5.16) Ncu／ml；在1+4+5模式中HBsAg、抗?HBe、抗?HBc的浓度分别为：(152.59±113.38) ng／ml、(25.73±12.54) Ncu／ml、(14.12±8.74) Ncu／ml；在1+5模式中HBsAg、抗?HBc的浓度分别为：(125.38±98.73) ng／ml、(12.52±5.79) Ncu／ml；在1+3模式中HBsAg、HBeAg的浓度分别为：(183.56±75.24 )ng／ml、(1.02±0.74) Ncu／ml；在1+4模式中HBsAg、抗?HBe的浓度分别为：(118.28±67.23) ng／ml、(24.49±6.89) Ncu／ml；1模式中HBsAg的浓度为(2.12±0.75) ng／ml。且1+3+5模式中HBsAg分布在200 ng／ml以上的占此模式的74.85%(125例)；在1+4+5模式中HBsAg分布在200 ng／ml以上的占此模式的39.62％(124例)；1模式中HBsAg的浓度在0.3 ng/ml～6 ng/ml之间。2+4+5模式中抗?HBs、抗?HBe、抗?HBc的浓度分别为：(637.52±578.25) mIU／ml、(18.24±10.92) Ncu／ml、(6.34±5.70) Ncu／ml；2+5模式中抗?HBs、抗?HBc的浓度分别为：(260.17±75.36) mIU／ml、0.29±0.11(Ncu／ml)；2+4模式中抗?HBs、抗?HBe的浓度分别为：(536.56±300.34) mIU／ml、(15.12±8.13) Ncu／ml；4+5模式中抗?HBe、抗?HBc的浓度分别为：(15.12±11.35) Ncu／ml、(12.24±10.11) Ncu／ml；2模式中抗?HBs的浓度为(289.34±156.29) mIU／ml；2+4+5模式中抗?HBs的浓度主要分布在870 mlU／ml以上；2+5模式和2+4模式、2模式中抗?HBs的浓度主要分布分别在130 mIU／ml～260 mIU／ml、130 mIU／ml～420 mIU／ml之间，5模式中抗?HBc的浓度为：0.60 Ncu／ml±0.28 Ncu／ml。
3 讨论
本实验中检出率居前5位的是1+4+5模式(43.47％)、1+3+5模式(23.19%)、2+4模式(7.36%)、2+5模式(5.42%)、2模式(3.19%)。可能同有些报道不一致，主要是本资料收集的标本绝大部分为乙肝患者血清。对乙肝抗原抗体模式及标志物浓度检测分布情况研究中，在一定程度上可看出乙肝标志物出现次序或乙肝临床转归情况。感染HBV后，最早出现HBsAg，其次为HBeAg、抗?HBc、抗?HBe、抗?HBs［3］。实验中，1+3+5模式中HBsAg浓度显著高于1+4+5模式、1+5模式、1+3模式、1+4模式、1模式HBsAg浓度，且从实验中也可见HBeAg及抗?HBe的出现与HBsAg的浓度呈一定的关系［4］，HBsAg浓度越高HBeAg检出率越高；有文献［5］报道HBV?DNA含量与HBeAg、HBsAg的存在有明显关系，HBeAg、HBsAg在一定程度上也能反映HBV?DNA的复制程度；1模式HBsAg浓度低，多为急性感染早期或隐性携带。2+4+5模式、2+4模式、2模式、2+5模式中抗?HBs浓度差异有显著性(P<0.01)，HBsAg的体液免疫应答是T细胞依赖的，产生的抗?HBs认为与循环中病毒清除有关，故抗?HBs是一种保护性抗体，是对乙肝感染后获得免疫力的标志，乙肝治愈或趋向治愈的象征。1+4+5模式、1+4模式中抗?HBe浓度显著高于2+4+5模式、4+5模式中的抗?HBe浓度；有HBsAg阳性或抗?HBe阳性模式中抗?HBc的浓度显著高于抗?HBs阳性模式中抗?HBc的浓度(P<0.01)；随着HBsAg阴转或抗?HBs出现，抗?HBc阳性率及浓度也随之降低，抗?HBs出现时抗?HBc浓度更低，这与机体对HBV的免疫应答有关。抗?HBe与抗?HBc不是保护性抗体，且抗?HBe阳性常伴抗?HBc阳性。研究表明抗?HBe检出率为肝癌>肝硬化>慢性乙肝，提示多数患者HBV感染时间较长，且抗?HBe主要见于低浓度HBsAg或抗?HBs阳性的急、慢性患者；抗?HBc浓度波动与病情呈平行关系，与病毒增殖和肝细胞损害有关，在临床上常用高浓度或低浓度来判断乙肝的转归和预后，如果检出高浓度提示患病中，且抗?HBc是HBV感染后血清中最早出现的标志抗体，是流行病学调查的良好指标，其效价高，持续时间长，甚至终生携带。近年来医学临床和预防的要求对低水平存在的血清学标志物进行有效检测，具有更重要的临床和流行病学意义。在部分HBV感染的人群中，血清表面抗原呈低水平存在，容易造成漏检。尤其是目前普遍采用的ELISA检测方法，对低水平人群更容易造成漏检(ELISA检测的灵敏度是2 ng/ml)。多方面研究表明，低水平血清HBsAg人群占有不小的比例，尤其我国是乙肝的高发区，加之人口众多，此类人群不容忽视。由于检查方法上的不灵敏，还可导致乙肝病毒通过手术，输血等途径发生传播等严重后果。因此，运用TRFIA法(灵敏度可达0.2 ng／ml)对乙肝5项进行定量检测极大地弥补了ELISA法定性检测的不足，成为乙型肝炎血清学标志物临床检验的方向。TRFIA技术具有定量检测功能，它对HBV?M临床检测的意义可简述为：动态观察疗效和监测病情；定量分析HBeAg和抗?HBe的浓度变化，可反映病情变化和效果；抗?HBc浓度的高低可反映病毒感染的状态；有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断；TRFIA和定量PCR技术可互相补充；抗?HBs的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用。
文献：
［1］ Diamandis EP Time?resolved fluorometry in nucleic acid hybridization and western blotting techniques［J］．Electrophoresis，1993，14(9)：866?875．
［2］ 黄飚，肖华龙，朱利国，等.甲胎蛋白时间分辨荧光免疫分析［J］．中华肝脏病杂志，2000，8(4)：248．
［3］ 唐珊熙.微生物学及微生物学检验［M］．北京：人民卫生出版社,2000:388.
［4］ 林永焕．现代传染病文集［M］．第3卷.北京：技术出版社,1995:54?58.
［5］ 柴红燕，刘芳，叶光明，等.血清乙型肝炎病毒DNA荧光定量检测及其与临床的关系［J］.检验医学与临床，2002，6(2)：38?45．
