HSF4基因突变导致常染色体显性遗传核性白内障
［关键词］ HSF4；基因突变；先天性白内障
Autosomal dominant congenital nuclear cataract caused by a novel mutation in the HSF4 gene
［Abstract］ Objective To identify the gene mutation causing autosomal dominant congenital nuclear cataract in a five-generation family. Methods According to gene mutation of special known loci in chromosome,linkage analysis was carried out with the D16S539 molecular marker.PCR and sequencing were used to detect the potential mutation in the candidate gene HSF4. Results Sixteen of the 69 individuals in the pedigree had congenital cataracts.A mutation of 134456 G→A in exon 3 of HSF4 gene was found in patients,but not in the normal member at family. Conclusion Mutation 134456（G→A） was firstly found in the Chinese patient with autosomal dominant congenital nuclear cataract,and it might be the genetic aspect of the cataract in this five-generation family.
［Key words］ HSF4;gene mutation;congenital cataract
先天性白内障是造成儿童失明和视力损害的重要原因，此外还有许多儿童因本病导致不可逆的弱视，经白内障摘除联合人工晶体植入手术后仍不能提高视力。先天性白内障根据晶状体混浊部位、形态和程度不同分为前极白内障、后极白内障、绕核白内障、核性白内障、点状白内障、膜性白内障等；其中以绕核白内障和核性白内障较常见。绕核性白内障为常染色体显性遗传；混浊位于透明晶状体核周围的层间，因此又称板层白内障。有时在此层混浊之外，又有一层或数层混浊，各层之间又有透明皮质间隔。最外层常有“V”字形混浊骑跨在混浊带的前后，称为“骑子”；常为双眼发病，视力可明显减退。核性白内障通常为常染色体显性遗传，少数为隐性遗传，也有散发病例。胚胎核和胎儿核均受累，呈致密的白色混浊，但皮质完全透明，多为双眼发病。先天性白内障约有1/3的病例是遗传性的［1］，单基因遗传的3种遗传方式，即常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、性连锁遗传，在先天性白内障家系研究中均有报道，但以常染色体显性遗传白内障(autosomal dominant cataract,ADC)最为多见［2］。白内障的遗传学研究仍落后于视网膜变性等其他眼科遗传性疾病［3］。从20世纪50年代即开始研究先天性白内障，到目前为止，已确定20多个ADC位点，其中有10多个基因已克隆［4~5］。
我们发现并收集了一个延续5代的常染色体显性遗传性白内障家系，并对该家系致病基因进行分析，以期弄清该家系中患者的遗传病因。
1 对象与方法
1.1 对象 该先天性白内障家系来自湖南郴州某山区，经家系调查,该家系成员5代共69人，患者16例。患者经扩瞳后裂隙灯及三面镜检查表型均为晶体核性混浊，且不伴有全身性疾病，诊断为核性白内障。经家系成员知情同意，采集其中17例（患者8例，正常者9例）的外周静脉血，制成干血滤纸片，-20 ℃低温保存；用常规酚-氯仿抽提法提取基因组DNA。
1.2 PCR引物合成 由于编码热休克转录因子（heat-shock transcription factor 4,HSF4）基因定位于16q21-q22.1;因此选择了 D16S539分子标记，首先进行连锁分析。其上下游引物序列分别如下：
STR16F：5?-cagatcccaagctcttcctct-3?
STR16R：5?-gtgtgtgcatctgtaagcatgt-3?
连锁分析结果显示，该家系中所检测到的患者都具有同样大小的一条带，而正常人都不具有这条带，所以初步判定致病基因在16号染色体上。而目前已知的16号染色体上与白内障有关的基因突变热点在HSF4第3外显子，因此根据HSF4的第3外显子突变热点区域情况合成HSF4特异性引物。（引物由上海生物工程公司合成）。引物序列见图2。
HSF4F：5?-ccacgccccactccccaga-3?
HSF4R：5?-CACCCCTCCTCCTCTTTGCT-3?
它们所在的位置（框内序列）如下:
134281 ccgggcggggagcggggatgggggactcggtgccggggatggggcgacccacgcccccac
gccccactcc ccaga
134356 cggttttcggaaggtggtgagcatcgagcagggcggcctgcttaggccggagcgcgacca 134415
134416 cgtcgagttccagcacccgagcttcgtgcgcggccgcgagcagctactggagcgcgtgcg 134475
gcgca aggtgggggc ggcctgcggg aatgagcaaa gaggaggagg
134521 ggtgctggga ctgcctgcct tgctcctgcg acccagtccc gacggtgcct cccgcctgca
134581 ggtgcccgcg ctgcgcggcg acgacggccg ctggcgcccg gaggacctgg gtcgactact
1.3 PCR扩增 PCR扩增D16S539的部分DNA片段。按PCR反应体系中剂量，向0.5 ml EP管中依次加入各试剂，短暂离心混匀；放入PCR扩增仪，于94 ℃预变性2 min，冰浴冷却后，再加入Taq DNA聚合酶0.3 μl,离心混匀；随后以94 ℃变性10 s，47 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s,循环35次后，再于72 ℃延伸5 min；置于4 ℃保存备用。
1.4 琼脂糖凝胶电泳 天平上准确称取琼脂糖3.6 g，加入0.5×TBE缓冲液120 ml，于微波炉中加热，使琼脂糖充分溶解，加热过程确保琼脂糖的浓度为3%；冷却到60 ℃~70 ℃后，小心加入8 μl EB混匀，再冷却至30 ℃以下；将凝胶托盘两端封好放平，倒入凝胶，再放上梳子；待凝胶完全冷却凝固后，小心拔去梳子，去除托盘两端的封胶膜，稍后放入电泳槽，加入0.5×TBE缓冲液使液面稍高于凝胶；小心点样，勿穿透加样孔；接通电源，以120 V电压，电泳50 min；用凝胶成像分析仪进行观察分析，挑选扩增良好的标本用于以下实验。
1.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 根据分子克隆操作手册介绍的方法制备8%非变性聚丙烯酰胺凝胶，分别将样品加入到点样孔中，于5 V/cm电压下电泳3 h； 0.5 μg/ml溴乙锭中染色10~30 min，紫外透射仪或凝胶成像系统上观察并照相记录电泳结果。
1.6 基因测序 选取带型不同的PCR产物，经纯化后在ABI3110自动测序仪上进行PCR产物直接测序验证。
2 结果
2.1 临床检查结果 经系谱调查，该家系5代69名成员中有16例患者，男女均有发病（见图3）。其遗传方式符合常染色体显性遗传。患者起始发病年龄均在2~16岁间，采血样的17例家系成员中，患者为8例，男女性各半，晶状体正常9例。经眼部专科检查表型为晶状体核性混浊，混浊形态完全一样，均为双眼发病；眼球正位，泪道通畅，球结膜正常，角膜透明；瞳孔2.5~3.5 mm，光反射尚存；晶状体皮质混浊，核分级Ⅰ~Ⅱ级。有5例患者曾作白内障摘除术（2例为单侧摘除）后置入人工晶体，视力仍较差，裸视力检查仅存光感。 图3 先天性核性白内障系谱图（略）
2.2 连锁分析结果 所有患者都具有同一条带，而正常人都不具有该条带，因此推测致病基因与16号染色体连锁（见图4）。
2.3 基因测序 患者测序全部得到突变杂合子134456G/A，该致病基因突变位点是134456G→A,其突变位点在基因中的位置（见图5）；正常人测序全部得到正常纯合子134456G/G(见图6)。注：箭头示杂合子C/T该变异经人类多态数据库查询未见此处多态性报道，因此涉及HSF4蛋白112位谷氨酸的同义突变。
3 讨论
1997年Ｎakai等用原位荧光免疫杂交技术将HSF4基因定位于16q21-q22［6］ ，2002年步磊等［7］对我国一板层白内障大家系进行全基因组连锁分析时发现该疾病位点于16q21-q22 ，与以前报道的Marner白内障的位点一致［8］。对该板层白内障大家系HSF4基因进行突变筛查，结果发现所有患者HSF4基因348位T→C碱基置换。推测该突变导致HSF4 DNA结合结构域第115位L被P取代。L115P突变破坏了HSF4 DNA结合结构域的α螺旋结构。HSF4蛋白调节热休克蛋白（heat shock protein,HSP）HSP70、HSP90A 和HSP27［6］。HSP在蛋白质的合成，组装，转移，折叠，修复以及变性的过程中充当分子伴侣的作用［9］。研究表明HSP 在胚胎晶体和成人晶体中广泛分布且分布区域特异［10］。可见HSP在晶体的发育过程中起着重要的作用。因此，HSP结构或表达异常可以导致白内障的发生。随着年龄的增加HSPs 分子伴侣的活性降低［11］。可能是HSF与DNA结合活性降低或功能丧失，从而使患老年性白内障的敏感性增加［12］。
该家系患者中，发病年龄最早2岁，最迟16岁，多在儿童期发病，且呈进行性核性混浊；男女发病无明显差别，临床诊断为常染色体显性遗传性核性白内障。16例患者中有5例曾做过白内障摘除、人工晶体置换术（其中2003年2例），手术最小年龄12岁，无论手术时年龄大小，视力恢复效果均不满意。家系成员连锁分析结果提示，所检测到的患者都具有同样大小的一条带，而正常人都不具有这条带；且目前已知16号染色体上与白内障有关的基因突变热点在HSF4第3外显子，按其区域情况合成HSF4特异性引物，PCR扩增该外显子DNA片段，扩增产物经纯化后于ABI377 自动测序仪进行直接测序分析，患者测序都得到突变杂合子134456G/A,正常人测序则都得到正常纯合子134456G/G。
我们首次发现由HSF4基因第3外显子134456G→A突变，并涉及HSF4蛋白112位谷氨酸的同义突变，这可能是导致该常染色体显性遗传性核性白内障表型发生的遗传病因。经密码子使用效率分析，发现在HSF4基因中编码谷氨酸的密码子中GAG为22个，GAA为9个，GAA的使用率约占29%。G→A突变后，是否会由于GAA的低使用率，抑或是引起剪切位点的变异，而引起HSF4蛋白翻译效率降低，进而导致该家系中患者白内障的发生有待进一步研究证实。目前已有一篇关于HSF4基因突变导致板层白内障的发生报道，HSF4基因突变导致先天性核性白内障的发生在国内尚属首次报道，这一新的发现必将帮助我们进一步了解先天性白内障的表型与致病基因的对应关系，并为研究揭示先天性白内障的发病机制提供重要的线索。
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