大肠埃希菌O157:H7检测方法探讨

【摘要】  目的  对大肠埃希菌O157:H7的检测方法进行探讨，减轻日常工作量，节约成本，提高阳性检出率。方法  将PCR技术和免疫磁珠法相结合，样品先进行PCR检测，阳性的样品再以免疫磁珠法进行分离和鉴定。结果  从245件猪粪、牛粪样品中应用免疫磁珠和PCR结合方法，阳性检出率为8.98%，高于直接应用免疫磁珠法的阳性检出率6.12%。结论  此方法为大肠埃希菌O157:H7的检测提供了一个新的思路，节约了人力和物力，提高了工作效率和阳性检出率。
   
    【关键词】  免疫磁珠法；大肠埃希菌O157:H7；PCR技术
   
    Study on method for detecting E.coli O157:H7
    
    【Abstract】  Objective  To discuss the detection  method for E.coli O157:H7.We can economize cost，release the work，enhance the positive rate.Methods  Combined the polymerase chain reaction technique with immunomagnetic sand method，we could detect these samples with PCR at first，and then collected and detected the positive species by using immunomagnetic sand method.Results  We have detected 245 species of dung by using this operational procedure.The result proved that the positive rate can be up to 8.98% above the rate of 6.12% by using immunomagnetic sand method only.Conclusion  It is a new idea for us to release the work and enhance the positive rate by using this operational procedure for detect the E.coli O157:H7.
   
    【Key words】  immunomagnetic sand method;  E.coli O157:H7; polymerase chain reaction 
    
    自从1982年在美国发生了首次由大肠埃希菌O157:H7引起出血性肠炎暴发以来，该菌在世界范围内曾有过多次食源性暴发。1996年在日本发生的人类上规模最大的一次暴发，引起了全世界的关注［1］。目前大肠埃希菌O157:H7 感染呈全球流行，已被认定是20世纪70年代以来新发现的8种传染病病原体之一［2］。我国亦加强了大肠埃希菌O157:H7的监测。为了提高阳性检出率，减轻工作量，本课题对大肠埃希菌O157:H7的检测方法进行了探讨和研究。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  样品来源  2004年5～10月采集奉贤区各个畜牧场猪粪、牛粪样品，共计245件。
   
    1.2  仪器与试剂
   
    1.2.1  PCR扩增仪  Techne Flexigene。
   
    1.2.2  大肠埃希菌O157PCR引物  上游引物：5’ AGGGCTATTGGTTCGTTCCT 3’，下游引物：5’ AGGCCTGAAAGTCGTAGCAA 3’，其扩增产物片段长度为519bp。上述引物及相关试剂由上海宝生科技有限公司合成提供。
   
    1.2.3  全自动数码凝胶成像系统  Tanon GIS-2010。
   
    1.2.4  免疫磁珠试剂、混匀器  (Dynabeads anti-E.coli O157;Dynal Sample Mixer)。
   
    1.2.5  培养基及诊断血清  MEC增菌液及各类糖发酵生化试剂均由上海市疾病预防控制中心提供。Chromagar O157显色平板由上海博塞科技发展有限公司提供。大肠埃希菌O157及H7诊断血清由成都生物制品研究所提供，均在有效期内使用。
   
    1.3  方法
   
    1.3.1  PCR检测法
   
    1.3.1.1  样品的前处理  将样品棉签置于MEC增菌液9ml中，42℃增菌18h后，以5合1的混合方式，将增菌液混合。2500rpm离心10min。取上清液500μl，12000rpm离心5min，弃上清液，加100μl DNA提取液入沉淀中，振荡混匀，置100℃水浴加热10～15min，10000rpm离心1min，保留上清液待用。
   
    1.3.1.2  PCR扩增反应  取4μl上清液加入26μl PCR反应液中，同时做阳性对照。振荡混匀，于2000rpm离心5s，将PCR反应管放入PCR扩增仪中。首先预变性94℃5min，然后按94℃ 30～40s、55℃ 30～40s、72℃ 30～40s循环35次，最后72℃延长3min。
   
    1.3.1.3  电泳及结果判断  取15μl的扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中，接通电源，根据指示剂迁移的位置，判断是否终止电泳。用凝胶成像系统对电泳结果进行分析。比较阳性对照，大肠埃希菌O157: H7特异性产物519bp为阳性。然后将PCR阳性的混合样品再进行单个PCR检测，确定单个阳性样品。
   
    1.3.2  免疫磁珠富集法  吸取样品增菌液1ml和20μl抗大肠埃希菌O157磁珠试剂于离心管中，置Dynal磁架上，放在混合器上轻轻搅动10min后，将磁板插入磁架，颠倒混匀3min，使浓缩磁珠吸附在管壁中间。打开离心管，小心吸取悬浮液，将磁板取下，加入1ml洗涤缓冲液(PBS-吐温)，盖上盖，将磁架颠倒数次，置于混匀器重新悬浮磁珠。重复洗涤，悬浮过程3次后，用100μl洗涤液冲洗悬浮浓缩的磁珠细菌混合物，做成混悬液。将混悬液接种于Chromagar O157显色平板，37℃培养24h。挑取可疑菌落于克氏双糖培养基，37℃培养24h后，血清凝集，并做生化反应。
   
    1.3.3  PCR技术与免疫磁珠法结合检测方法  将经PCR检测为阳性的样品再进行免疫富集分离鉴定。
   
    2  结果
   
    2.1  大肠埃希菌O157:H7检出情况  不同大肠埃希菌O157:H7分离方法取得的阳性率有所不同。PCR方法阳性检出率最高，达 10.2%。免疫磁珠法检出15株，阳性检出率为6.12%，两者结合方法的阳性检出率为8.98%。见表1。

表1  不同方法大肠埃希菌O157：H7检测结果

    2.2  大肠埃希菌O157:H7菌株鉴定  检出的22株可疑菌株均为革兰阴性无芽孢短杆菌，生化反应符合大肠埃希菌特征，经大肠埃希菌O157、H7诊断血清进行玻片凝集反应，确定大肠埃希菌O157:H7菌株１５株，O157:H-菌株７株。送上海市疾病预防控制中心微生物实验室进行毒素基因测定，结果均为阴性。
   
    3  讨论
   
    应用免疫磁珠技术检测大肠埃希菌O157:H7在本实验室使用的是半自动混匀器，所以不仅操作费时费力，所需时间较长，且免疫磁珠试剂成本较高，不适合大批量的样品同时检测。而PCR技术能将死菌与含菌量极微的细菌都能检测出，因此阳性率最高，但通过实验发现有一部分样品虽然PCR检测为阳性，却未能通过分离鉴定到菌株。所以PCR的结果只是定性结论，为阳性菌的检出提供一个指导方向［3］。因此本课题将PCR技术和免疫磁珠技术相结合，利用PCR的快速鉴定，将5个样品混合为一个样品进行检测，将PCR检测阳性的样品，再以免疫磁珠法进行分离鉴定。这样既减少了工作量，节约了人力，又降低了试剂成本。
   
    通过实验发现，用PCR技术和免疫磁珠技术相结合的方法检测大肠埃希菌O157:H7，阳性检出率由用免疫磁珠法的6.12%提高到8.98%，说明此方法提高了大肠埃希菌O157:H7的阳性检出率，这对于今后大肠埃希菌O157:H7的监测工作有很大帮助。
   
    本次监测分离到的大肠埃希菌O157:H7虽然经分析是非产毒株，但都证实了大肠埃希菌O157:H7在奉贤地区的存在，具备了大肠埃希菌O157:H7感染的客观因素，不容小视。而携带病原菌的家畜粪便可通过各种途径污染食品、饮水和蔬菜，是重要的传染源［4］。因而，今后应加强对畜牧场的大肠埃希菌O157:H7的监测工作，加强消毒，严防粪便污染，环境尤为重要。

【】

    1  季晓辉.肠出血性大肠埃希氏埃希菌的鉴定与检测.国外医学·卫生学分册，1997，24(3):174-177.
    2  朱姝媛，徐庆，李刚山，等.大肠埃希菌O157: H7的分离鉴定及应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子.卫生检验杂志，2004，14(4):445-446.
    3  顾鸣，韩伟.复合PCR鉴定沙门菌的方法.中国卫生检验杂志，2003，13(2):154-157.
    4  冉陆.肠出血性大肠埃希菌(EHEC)流行趋势.中国食品卫生杂志，1999，3:31-35.

1.3.1.3  电泳及结果判断  取15μl的扩增产物加入2%琼脂糖凝胶孔中，接通电源，根据指示剂迁移的位置，判断是否终止电泳。用凝胶成像系统对电泳结果进行分析。比较阳性对照，大肠埃希菌O157: H7特异性产物519bp为阳性。然后将PCR阳性的混合样品再进行单个PCR检测，确定单个阳性样品。
   
    1.3.2  免疫磁珠富集法  吸取样品增菌液1ml和20μl抗大肠埃希菌O157磁珠试剂于离心管中，置Dynal磁架上，放在混合器上轻轻搅动10min后，将磁板插入磁架，颠倒混匀3min，使浓缩磁珠吸附在管壁中间。打开离心管，小心吸取悬浮液，将磁板取下，加入1ml洗涤缓冲液(PBS-吐温)，盖上盖，将磁架颠倒数次，置于混匀器重新悬浮磁珠。重复洗涤，悬浮过程3次后，用100μl洗涤液冲洗悬浮浓缩的磁珠细菌混合物，做成混悬液。将混悬液接种于Chromagar O157显色平板，37℃培养24h。挑取可疑菌落于克氏双糖培养基，37℃培养24h后，血清凝集，并做生化反应。
   
    1.3.3  PCR技术与免疫磁珠法结合检测方法  将经PCR检测为阳性的样品再进行免疫富集分离鉴定。
   
    2  结果
   
    2.1  大肠埃希菌O157:H7检出情况  不同大肠埃希菌O157:H7分离方法取得的阳性率有所不同。PCR方法阳性检出率最高，达 10.2%。免疫磁珠法检出15株，阳性检出率为6.12%，两者结合方法的阳性检出率为8.98%。见表1。

表1  不同方法大肠埃希菌O157：H7检测结果

    2.2  大肠埃希菌O157:H7菌株鉴定  检出的22株可疑菌株均为革兰阴性无芽孢短杆菌，生化反应符合大肠埃希菌特征，经大肠埃希菌O157、H7诊断血清进行玻片凝集反应，确定大肠埃希菌O157:H7菌株１５株，O157:H-菌株７株。送上海市疾病预防控制中心微生物实验室进行毒素基因测定，结果均为阴性。
   
    3  讨论
   
    应用免疫磁珠技术检测大肠埃希菌O157:H7在本实验室使用的是半自动混匀器，所以不仅操作费时费力，所需时间较长，且免疫磁珠试剂成本较高，不适合大批量的样品同时检测。而PCR技术能将死菌与含菌量极微的细菌都能检测出，因此阳性率最高，但通过实验发现有一部分样品虽然PCR检测为阳性，却未能通过分离鉴定到菌株。所以PCR的结果只是定性结论，为阳性菌的检出提供一个指导方向［3］。因此本课题将PCR技术和免疫磁珠技术相结合，利用PCR的快速鉴定，将5个样品混合为一个样品进行检测，将PCR检测阳性的样品，再以免疫磁珠法进行分离鉴定。这样既减少了工作量，节约了人力，又降低了试剂成本。
   
    通过实验发现，用PCR技术和免疫磁珠技术相结合的方法检测大肠埃希菌O157:H7，阳性检出率由用免疫磁珠法的6.12%提高到8.98%，说明此方法提高了大肠埃希菌O157:H7的阳性检出率，这对于今后大肠埃希菌O157:H7的监测工作有很大帮助。
   
    本次监测分离到的大肠埃希菌O157:H7虽然经分析是非产毒株，但都证实了大肠埃希菌O157:H7在奉贤地区的存在，具备了大肠埃希菌O157:H7感染的客观因素，不容小视。而携带病原菌的家畜粪便可通过各种途径污染食品、饮水和蔬菜，是重要的传染源［4］。因而，今后应加强对畜牧场的大肠埃希菌O157:H7的监测工作，加强消毒，严防粪便污染，环境尤为重要。

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    1  季晓辉.肠出血性大肠埃希氏埃希菌的鉴定与检测.国外医学·卫生学分册，1997，24(3):174-177.
    2  朱姝媛，徐庆，李刚山，等.大肠埃希菌O157: H7的分离鉴定及应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子.卫生检验杂志，2004，14(4):445-446.
    3  顾鸣，韩伟.复合PCR鉴定沙门菌的方法.中国卫生检验杂志，2003，13(2):154-157.
    4  冉陆.肠出血性大肠埃希菌(EHEC)流行趋势.中国食品卫生杂志，1999，3:31-35.