类天疱疮的临床特征与其靶抗原关系的研究*

   作者：金 岩1，黄 懿1，成 扬2，付海军3

【摘要】  对56例江浙沪地区类天疱疮患者的临床特征和不同靶抗原的关系进行了探讨，发现类天疱疮多发于老年人，并以大疱性多见；在BP的急性期抗体结合230kD、230/180kD、合并条带靶抗原较常出现(86.11%)；而在疾病的缓解期抗体结合180kD抗原较常出现(65%)；180kD靶抗原并非次要抗原。
   
    【关键词】  类天疱疮；临床特征；靶抗原
    
    【Abstract】  56 cases of bullous pemphigoid(BP) were studied on the clinical characters and immunol-blot patterns.It was found that bullous pemphigoid happened mostly among old people in bullous type；Autoantigen BP230，BP230/180 and BP 230/180 combined with minor antigens involved in acute phase of BP patient；While BP180 involved mainly in the remission of the disease.Autoantigen BP180 were not minor antigen.
   
    【Key words】  bullous pemphigoid；clinical characters；autoantigen
   
    大疱性类天疱疮(BP)是一种发生于老年人的自身免疫性大疱病，临床表现为全身泛发性、张力性大疱，尼氏征阴性，病程反复迁延，严重威胁患者的生命健康。BP血清中有多种抗皮肤基底膜不同成分的抗体，有靶抗原分子量为230kD、200kD、180kD、140kD、100kD等，为了进一步探讨BP的临床特征和其靶抗原的关系，我们拟对临床收集的56例病例及其免疫印迹的结果综合分析。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  临床资料
   
    1.1.1  研究对象  选择1999年12月～2001年12月华山皮肤科和东方医院门诊、病房就诊的江、浙、沪地区汉族类天疱疮患者，根据临床表现、组织病理和直接免疫荧光检查，符合诊断标准确诊。
   
    1.1.2  方法  我科专病门诊、病房大疱病患者，常规做病理活检，手术时将切下的组织块分为两份，一份做常规组织病理检查，另一份做直接免疫荧光检查；确诊的BP患者抽取外周新鲜血5ml，留血清-20℃冻存用于测定BP抗原分子量；除对患者的一般情况如年龄、性别、发病时间等进行记录外，并根据以下内容对BP病例进行登记、随访。(1)临床类型：根据临术表现将BP分为大疱性、小疱性、局限性和痒疹性等。(2)黏膜损害情况：①有黏膜损害；②无黏膜损害。(3)痒感：①有明显痒感；②无明显痒感。(4)病情：①重度：指不断出现张力性水疱和显著红斑，累及体表面积50%以上；②中度：指皮损面积在20%～50%之间；③轻度：皮疹散在分布或局限在身体某一部位，皮疹面积在20%以下。(5)病期：①活动期：指患者不断出现张力性水疱和显著红斑；②稳定期：无明显水疱发生，只有陈旧皮损。
   
    1.2  皮肤表皮抗原的提取
   
    1.2.1  材料
   
    1.2.1.1  组织  取新鲜外科截肢手术皮肤6cm×6cm数块。
   
    1.2.1.2  主要试剂及仪器  三羟甲基氨基甲烷(TRIS，FARCO产品)；苯甲基磺酰氟(PMSF，Promega产品)；依地酸钠(EDTA，Sigma产品)；蛋白酶抑制剂(pepstatin，antipain，leupeptin，chymostotin，Sigma公司产品)；十二烷基硫酸钠(SDS，日本进口分装)；高速低温离心机(HITACHI，日本进口)；751型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；热分离缓冲液；12.5mmol TRIS-HCl，pH6.8，100μl PMSF(热分离前加)；表皮提取液：2%SDS，65mmol TRIS-HCl，pH6.8，20mmol PMSF，10mmol EDTA，含四种蛋白酶抑制剂(热分离前加)。
   
    1.2.2  方法  (1)新鲜外科手术皮肤标本，用图钉固定在木板上，用手术刀除皮下脂肪组织，削真皮至0.5mm厚，冷生理盐水反复冲洗。(2)热分离缓冲液分两份，一份置37℃水浴，另一份置56℃水浴，10min备用。(3)将皮肤剪成2cm×2cm大小，放入37℃热分离缓冲液20min，再迅速放入56℃热分离缓冲液中40s，取出冷却，用手术刀背轻轻分离表真皮。(4)表皮按25～30cm2比1ml的比例加入表皮提取液中，放入组织匀浆器内匀浆(匀浆器放冰中)。(5)匀浆液置塑料管中，于液氮中反复冻融3次，每次10min，后12000rpm离心，4℃，30min，取上清即为表皮提取液，-40℃保存。 (6)751分光光度计测定表皮抗原提取液蛋白含量，在595nm处测OD值，参照标准蛋白(小牛血清白蛋白)，样品中蛋白含量。
   
    1.3  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
   
    1.3.1  材料  (1)表皮抗原提取液；(2)主要试剂及仪器丙烯酰胺(acrylamide，Fluka产品)；甲叉丙烯酰胺(N，N′-Methylenebis-acrylamide，Fluka产品)；四甲基已二胺(TEMED，Promega产品)；过硫酸胺(APS，华美公司产品)；次高分子量标准分子蛋白(上海生化所产品)；甘氨酸(Gly，上海试剂三厂，分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(TRIS，FARCO产品)；2-巯基乙醇(2-ME，Fluka产品)；垂直电泳槽(上海精益有机玻璃制品厂)；稳流稳压电泳仪(丹阳无线电一厂)；聚丙烯酰胺母液(Acr-Bis，丙烯酰胺30g，甲叉丙烯酰胺0.8g，双蒸水加至100ml，磁力搅拌溶解，过滤，置棕色瓶4℃保存)；浓缩胶(Acr-bis 0.6ml，0.5M pH6.8 1.25ml，双蒸水3.1ml，10%SDS 0.05ml，10%APS 0.025ml，TEMED 5μl)；分离胶(Acr-Bis 2.3ml，1.5M pH8.8 Tris-HCl 2.5ml，双蒸水5ml，10%SDS 0.1ml，10%APS 0.1ml，TEMED 10μl)；电泳缓冲浓缩液(Tris 15g，Gly 7.2g，SDS 5g，双蒸水加至500ml，过滤，使用时1∶10稀释)；样品液(12mM Tris-HCI pH6.8，含20%甘油，10%SDS，10%2-ME，溴酚蓝适量)。表皮提取液与样品液1∶1混合，用时煮沸；固定液(500ml无水乙醇，100ml冰醋酸，400ml双蒸水)；脱色液(250ml无水乙醇，80ml冰醋酸，加双蒸水至1000ml)；染色液(考马斯亮兰0.29g，加250ml脱色液，棕色瓶4℃保存)。
   
    1.3.2  方法
   
    1.3.2.1  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳  将干净的长短玻璃板用橡皮圈套好，放入垂直电泳槽，螺母固定，底边缝隙用1%琼脂封闭，配制分离胶，轻倒入两玻璃板间空隙内，再加入少量含正丁醇双蒸水，将分离胶压平，静置，过夜，倒去水，配制浓缩胶，轻倒入分离胶上方空隙内，插入塑料梳，静置3h。轻取塑料梳，分别加入标准品和样品，两侧水槽内加入电泳缓冲液，100V，1h，再160V 3～4h。
   
    1.3.2.2  显色  将电泳好的凝胶小心取出，放入固定液中，置摇床上摇动1h；再将凝胶放入染色液中，56℃，摇动10min；再放入脱色液中，摇动过夜。最后观察凝胶上抗原蛋白的分离效果确定是否转印。
   
    1.3.2.3  蛋白质抗原分子量的测定  在一定的分子量范围内，蛋白质的泳动率和分子量的对数呈直线关系。

logMW＝K1-bx
b：斜率；x：泳动率

    在实际测定时，可先测量标准蛋白质自分离胶起点至区带中线距离做横轴坐标，然后将标准蛋白质分子量换算成对数值作纵坐标，作出标准曲线。测量蛋白抗原的电泳距离，在曲线上查出相应的分子量的对数值，即可计算出待测蛋白质的分子量。
   
    1.4  Western-blot
   
    1.4.1  材料
   
    1.4.1.1  材料  经上述SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳好的凝胶。
   
    1.4.1.2  试剂和仪器  甘氨酸(Gly，上海试剂三厂)；小牛血清白蛋白(BSA，中科院生化所产品)；辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG抗体(Sigma产品)；半干式转印电泳槽(上海医科大学仪器中心产品)；硝酸纤维膜(NC，浙江黄岩生化材料厂)；印度墨水染色液(12.5mM Tris-HCI，pH 6.8，1%印度墨水)；转移电泳缓冲液(Tris 3g，Gly 14.4g，SDS 1g，ddH2O 600ml，临用前加入甲醇150ml)。
   
    1.4.2  方法
   
    1.4.2.1  蛋白转移电泳  将电泳好的凝胶去除浓缩胶和琼脂糖，置于转移电泳液中20min，裁取与凝胶相同大小的NC膜和6张滤纸，另置于转移电泳液中15min，将3张湿滤纸、NC膜、凝胶、3张湿滤纸依次叠压在一起，放入半干式转印电泳槽中，再加入适量转移电泳液，50V，电泳1h左右，将NC膜取出，用印度墨水染液染色，观察转移效果和标准蛋白位置。
   
    1.4.2.2  固相酶免疫检测  抗原印迹NC膜放入PBS(含5% BSA、0.5% Tween-20)溶液中，室温下平缓摇动5h；再切成3mm宽的条带，置于反应槽中，加入按1∶10稀释的待测血清及健康对照血清各1ml，室温下平缓摇动2h，倾去反应液，用免疫印迹洗涤液洗涤三次，加入1∶400稀释辣过氧化物酶标记羊抗人IgG(HRP-IgG)溶液1ml；室温下平缓摇动1h，倾去反应液，用免疫印迹洗涤液洗涤三次，加入显色底物液，至出现明显的区带，双蒸水洗涤，2M H2SO4终止反应。

    
    2  结果
   
    2.1  临床资料  根据临床表现、组织病理及直接免疫荧光检查共确诊56例BP患者，其中男32例，女24例，男∶女＝1∶33；年龄范围36～94岁，平均年龄(66.64±14.09)岁，病程从0.5～1个月，平均病程(5.55±19.54)个月。其年龄分组情况见表1和图1。

表1  56例BP患者的年龄构成

 

 

图1  研究对象的年龄构成

    56患者中，黏膜损害的有17例，占30.36%。有痒感的25例，占44.64%，严重程度病情比较重的有32例，占57.14%；病情较轻的有24例，占42.86%；类型中大疱性的有48例，占85.71%；非大疱性的有8例，占14.29%。急性期的有39例，占69.64%；缓解期的有20例占35.71%。
   
    从表1可看出，BP患者的发病年龄50岁以下的有12例，占21.43%，60岁以上的有40例，占71.4%。结果显示BP多发于老年人。
   
    2.2  56例BP患者的免疫印迹结果  免疫印迹部分结果见图2(见附页1)。从图2看出，BP患者血清可结合230kD、180kD、230/180kD或230、180合并100kD等条带。

    
    56例BP患者中，免疫印迹阳性的有50例(89.28%)，阴性的有6例(10.71%)；阳性者中，单独抗原分子量180kD阳性的有16例(28.57%)，单独230kD阳性的有4例(7.14%)，230kD、180kD同时阳性的有11例(19.64%)，230kD和(或)180kD合并其他200kD、140kD、100kD的有18例(32.14%)。
   
    2.3  急性期、缓解期与免疫印迹结果的关系  免疫印迹与病期对应情况见表2和图3。

表2  免疫印迹与病期对应情况表  病例数(%)

 

 

                       图3  免疫印迹与病期对应图

    
    表2和图3显示：在BP的急性期抗体结合230kD、230kD/180kD、合并条带抗原的占86.11%；疾病的缓解期抗体结合180kD抗原的占65%。
   
    3  讨论
   
    类天疱疮是一种好发于老年人的自身免疫性大疱病，临床表现为红斑基础或正常皮肤上的紧张性大疱，尼氏征阴性，病情重者皮损累及全身，并可有黏膜损害，痒感轻重不等；病情轻的皮损可散在分布，也可表现为局限性分布。类天疱疮可分为大疱性类天疱疮、局限性类天疱疮、疤痕性类天疱疮、多形性类天疱疮等，其病情反复迁延，可急性发作或临床缓解。大多数类天疱疮对激素敏感，用激素疗效较好；少数对激素不敏感，须用免疫抑制剂、美满霉素或雷公藤制剂等。
   
    56例类天疱疮的临床研究资料表明，类天疱疮多发于60岁以上的老年人，就发病年龄不同于其他结缔组织病，其原因尚待进一步探讨。类天疱疮的黏膜损害较天疱疮少见，本研究中黏膜损害约占30%左右，而我科有关天疱疮的资料表明天疱疮的黏膜损害约占70%～80%左右；类天疱疮以大疱性类天疱疮最常见，其次为局限性、小疱性、痒疹性。
   
    BP患者如不进行治疗。其病情可延续数月至数年。国外曾经有一项预测BP进程的研究，作者对该病的多项临床及实验室特征进行了分析，未能发现任何可预测疾病进程的指标［1］。最近有两项对BP自身靶抗原与疾病预后相关性的研究，证实存在抗BPAG2循环抗体的患者病情较重，需要更大剂量的皮质类固醇激素控制病情，预后差［2，3］。说明BPAG2自身抗体在该病发病过程中起更重要的作用。
   
    免疫印迹技术常用于检测类天疱疮抗体，充分地提取表皮基底膜中的蛋白抗原成分，是运用免疫印迹技术测定该类抗体的重要组成部分。目前常用的分离表、真皮的方法有三种，即0.1mol/L EDTA分离法、56℃热分离法和1mol/L NaCI分离法，我们实验室采用56℃热分离法分离表、真皮，结果表明本法对抗原活性影响较小且敏感性好，提取液中蛋白含量可达50mg/ml。
   
    类天疱疮是一种自身免疫性大疱病，其患者血清中有多种抗皮肤基底膜不同成分的抗体，有靶抗原分子量为230kD、200kD、180kD、140kD、100kD等，目前较公认的类天疱疮抗体是抗原分子量为230kD和180kD，即BPAG1、BPAG2。我们的研究结果证实BP患者中有抗上述分子量蛋白的抗体。为了了解其与BP患者的临床特征及易感基因的相关性，我们将上述抗体分为较常见的180kD、230kD、180kD和(或)230kD合并其他条带四组进行总结。
   
    我们的研究结果显示在BP的急性期抗体结合230kD、230/180kD、合并条带抗原较常出现(86.11%)；而在疾病的缓解期抗体结合180kD抗原较常出现(65%)，这与国内外的有关报道是一致的［4］。
   
    研究表明类天疱疮抗体主要与基底膜区的两个大分子多肽反应，即230kD、180kD分子。在较早期国外的免疫印迹结果显示BP血清中有50%～70%能检出230kD抗体，30%～50%血清中能检出180kD抗体，故有的中称230kD抗原为BP的主要抗原，180kD抗原为BP的次要抗原［5］，但近年来国内的研究结果发现180kD抗体的检出率高于230kD，180kD抗原并不是BP的次要抗原。我们的免疫印迹结果显示230kD抗体阳性为36例，占64.29%；180kD抗体阳性为41例，占73.21%，180kD抗体阳性率高于230kD抗体，且180kD抗体在疾病的急性期有阳性，在缓解期也持续阳性，提示这两种抗体在疾病的不同时期其作用是有差异的。
   
    目前已知编码BP抗原230kD的基因位于6号染色体短臂的6p11-12位点，编码180kD的基因位于10号染色体长臂的10q24.3位点上，两组基因表达的蛋白氨基酸顺序和结构不同，230kD含2606个氨基酸，其空间结构可能是双螺旋；180kD蛋白由1572个氨基酸组成，其结构有许多胶原域。超微结构定位表明BGAG1是一个细胞内蛋白，是构成半桥粒致密斑块的主要成分；BPAG2是一个跨膜蛋白，其氨基端约55kD位于半桥粒致密斑块上，羧基端约100kD在细胞外，中间是较短的跨膜域；这些BP抗原的编码基因、氨基酸顺序及结构、超微结构的差异决定了BPAG1、BPAG2这两类靶抗原在疾病中的作用是不同的。
   
    近来研究的研究结果显示，BPAG1和BPAG2在BP的发病过程中，其抗原性发生某种变化，导致器官特异的自身免疫，由于BPAG2的抗原决定簇在细胞外胶原域，首先激发免疫反应，自身抗体与BPAG2结合后激活补体，造成细胞膜破裂，此时细胞内的BPAG1的抗原决定簇也暴露，刺激免疫系统产生新的抗体，因此有人认为BPAG2在BP的发病过程中起更重要的作用，很可能是BP自身免疫发病中的始动因子；故在临床上当患者BPAG1抗体增高时，疾病常处于进展期。

【文献】

    1  Collagen XVII/BP180：a collagenous transmwmbrane protein and component of the dermepidermal anchoring complex.Clin Exp Dermatol，2005 Nov，30(6)：682-687.    
    2  Demonstration of the molecular shape of BP180，a 180-Kda Bollous pemphigoid antigen and its potoential for trimer formation.J boil Chem，1996，271：13739-13745.    
    3  Clinical manifestation in 100 Japanese billoss pemphigoid casea in relation to autoantigen profiles.Clin Exp Dermatol，1996，21：23-27.    
    4  Anti-BP180 autoantibodies as a marker of poor prognosis in bullous pemphigoid.Br J dermatol，1997，136：694-698.    
    5  Serum levels of autoantibodies to BP180 correlate with disease activity in patients with bollous pemphigoid.Arch Dermoto，2000，136：174-178.