HCV检测现状及新进展

【摘要】  丙肝是严重威胁人类健康的传染病之一，主要通过血液传染。我国平均感染率为3.2%。北方稍高，约为4.6%，南方为2.6%～2.9%，感染人数估计有3700万。受感染的母亲传播给婴儿的发生率为5%。患急性肝炎后约有50%～70%的感染者有转为慢性肝炎的倾向，重者20～25年后可转化为肝硬化，肝硬化患者10年内有大约30%的为终末期肝病[1-2]，并且HCV感染与原发性肝细胞癌有较密切的关系。对于HCV感染者，第3、5、7、10年的肝癌累积发生率达11%、18.1%、29%、45.6% [3]。随着医学检验的迅猛发展，HCV检测技术也不断提高．但与检测乙型肝炎病毒（HBV）相比，HCV的检测还有许多难题有待解决。
【关键词】  HCV  抗–HCV  RNA  ELISA  RT-PCR
        HCV检测目前存在的主要问题有：1.由于HCV抗原结构的特殊性，直接检测血清中HCV抗原的技术问题还未彻底解决。2.抗体（抗－HCV）出现时间晚，从HCV感染后到抗体转阳的时间平均为50～70天，有的患者可延长至6～9个月，检测的“窗口期”较长。3.病毒基因型复杂而且容易变异，使基因水平的检测质量不够稳定。随着有关人员近年来的不断努力和相关的迅猛发展，已经在HCV检测技术方面有了重要进展。
        1  第三代抗－HCV试剂的应用
        检测丙型肝炎病毒抗体（抗HCV）仍是目前常用手段，这方面的检测方法主要是第三代酶免疫测定法（EIA）或间接酶免疫法（ELISA），我国大多采用ELISA方法。
        ELISA方法中包被抗原的组成和质量是关键因素。第三代ELISA试剂比第一、第二代试剂有明显的改进，其包被的抗原为HCV核心抗原NS3、NS4和NS5。由于第一、第二代试剂的重组基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以都存在抗－SOD造成的假阳性。而第三代HCV试剂，用北方地区HCV全基因序列，根据开发的预测蛋白理化性质及三级结构和抗原决定簇的位点的序列软件，完成了HCV全基因序列的亲水性﹑亲近性﹑移动性分析，已预测到HCV抗原决定簇的位点。第三代试剂的特异性达到99%[4]。抗－HCV检测可成为丙型肝炎病毒早期感染的检测指标[5]。
        HCV感染通常是持续的终生感染。虽然第三代HCV抗体ELISA试剂增加了HCV Ns5区表达的蛋白作为抗原，提高了试剂敏感性，HCV感染的“窗口期”通常还需要平均40多天。因此，第三代ELISA试剂仍需要提高和改进，例如在筛查试验的特异性方面，仍存在假阳性结果。对强阳性或弱阳性样本的检测，国产试剂（主要厂家）的s/co值高于进口试剂，但是无论对阳性及阴性样本检测，国产试剂的CV值及特异性均明显低于进口试剂，以致出现更多的假阳性结果。此外，丙肝抗体酶免试剂皆没有灰区的设定，s/co比值较低（但大于１）的结果也报告阳性，亦是假阳性比较多的原因。[6]
        2  丙型肝炎病毒抗原检测方法的建立
        多年来，专业人员一直探索能够直接检测HCV抗原，以达到缩短窗口期的目的。但是由于HCV抗原的特殊性和相关抗体制备中存在的困难，使这方面的进展受到阻碍。
        2.1 HCV核心抗原检测
        HCV核心抗原是HCV感染者体内出现的早期感染指标，几乎与HCV  RNA同时出现，核心抗原和HCV RNA的动力学变化密切相关。
        HCV核心抗原检测用双抗体夹心法定性或定量检测血清样品中的HCV核心抗原，其基本原理是：以基因工程核心抗原免疫小鼠后获得的纯抗HCV核心抗原单克隆抗体作为固相包被物，用与固相包被物有不同抗原决定簇的抗-HCV核心抗原单克隆抗体作为辣根过氧化物酶标记物，与血清中的HCV核心抗原反应，OPD显色后进行定性或定量测定。该方法不受被检测样品中抗-HCV的干扰，检测结果准确可靠。可用于HCV早期急性丙型肝炎诊断，抗-HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者前后病毒血症追踪分析[7]。
        有报道，HCV-CAg检测可以较HCV抗体检出时间提早23～46d[8]，且EIA法较PCR法简便、快速，现有能力开展ELISA检测的实验室无需增加特殊设备，均可检测。其结果与RT-PCR方法的复合率为85.71%。因此，在不具备RNA检测条件的实验室开展HCV-CAg检测时很好的筛查方法。有报道，在对180例抗-HCV阴性患者的筛查中，检出HCV－CAg阳性2例，表明仅用抗－HCV检测将有可能存在0.55%感染者漏诊的风险，尤其是对手术前丙肝病毒筛查的病例，它涉及到术中感染责任和用血安全等问题。丙肝核心抗原检测在一定程度上降低了这些风险。因此,丙肝核心抗原检测可作为HCV抗体检测的补充试剂。
        2.2 HCV抗原检测
        十几年来，一些学者曾经试图建立血清中各种HCV抗原的检测方法，但由于血液中HCV抗原含量太低，用常规方法无法检测出。近年来，由于HCV单克隆抗体的研究成功，已有国内外学者发表了肝组织及人体分泌物中HCV抗原检测成功的报导。如果能加强对HCV中和抗体Wv、抗-HCV-IgM、抗-HCV核心抗体的研究[9]，进一步开发对血清及肝组织内HCV抗原的测定，可能会在丙肝的实验诊断方面取得更大进展。
        3  丙型肝炎病毒RNA的检测
        现在用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测血清中的HCV RNA。基本原理是首先经逆转录酶作用，在特异性引物存在下，将HCV RNA逆转录为单链的CDNA，再通过PCR将CDNA扩增。定性PCR的灵敏度高于定量PCR。罗氏公司的定性PCR的灵敏度为50KIU/L，定量PCR为600KIU/L；拜尔公司的定性PCR的灵敏度为10KIU/L，其定量PCR为615KIU/L。定性PCR检测主要用于急性丙型肝炎诊断，而定量PCR则用于疗效监测。
        最新报导，应用转录介导的扩增系统(TMA)可以将HCV RNA的检出率提高到5～10Iu/ml的水平。其原理为：目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成双链的DNA，并在T7 RNA多聚酶的作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自我催化过程，灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高，无需专门的扩增仪器，整个反应在一个试管中进行，减少污染。 
参 考 文 献 
[1] straderDB,wrightT,ThomasDL,Hepatology,2004,39:1147-1171.
[2] 周永兴.世界华人消化杂志,2004,12:2369-2371.
[3] 谢立,吴晓东.世界华人消化杂志,2005,13:884-886.
[4] 邢文革,郑怀竞.中华肝脏病毒杂志，2004，12：170-171.
[5] Lunel F、Villon P、Payan C，Hepatology，2002，36（pt2）：353.
[6] 王国华、张贺秋、李少波等.丙型肝炎核心抗原检测试剂的研究及初步应用[J]|输血杂志，2004，17（5）：11-14.
[7] 孟淑芳,李秀华,尹红章等.丙型肝炎病毒抗原检测方法的建立[J]|中华试验和临床病毒学杂志，2001，15（3）：287-290.
[8] Villo SA，Vlahov D，Nelson KE，Cohn S，Thomas DL，Hepatology，1999，29：908-914.
[9] 郝飞,李梦东.中华内科杂志，1994，33：593-594.