高压氧对肾虚豚鼠药物所致听觉功能损伤的影响
作者：王永华 章菊琴 张梅丽
【摘要】 目的］ 观察高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）对肾虚豚鼠药物所致听觉功能损伤的干预效果并探讨其作用机制。［方法］将30只雄性豚鼠随机分为正常对照组（正常组）、肾虚耳聋模型对照组（模型组）、肾虚耳聋高压氧组（治疗组）。肌注醋酸泼尼松龙注射液及硫酸卡那霉素进行肾虚耳聋模型造模，再将治疗组豚鼠置于实验舱内吸氧，正常组豚鼠不作任何处理。观察各组豚鼠听性脑干诱发电位（ABR）的反应阈、各波潜伏期及波间期的变化；耳蜗螺旋韧带及基底膜铺片，光镜下观察耳蜗血管纹及毛细胞的形态变化；耳蜗琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）染色，光镜下观察耳蜗毛细胞的SDH活性变化。［结果］治疗组ABR反应阈升高幅度明显低于模型组（P<0.01）；模型组豚鼠ABR各波潜伏期延长亦比治疗组明显，两组之间及两组分别与正常组比较均有显著性差异（P<0.01）；而各波间期比较，三组差异无显著性（P>0.05）。模型组SDH显色变淡或消失，毛细胞受损显著，血管纹缺血明显，治疗组SDH变化、毛细胞受损及血管纹缺血程度均明显低于模型组。［结论］ HBO对肾虚型听功能损伤有一定的治疗作用，但不能使听功能恢复正常；其可能机制为改善内耳微循环和提高内耳酶活性。
【关键词】 听觉损伤；高压氧；豚鼠；肾虚；琥珀酸脱氢酶
近10年来，国内应用补肾活血中药为主治疗耳聋已取得了显著成效，我们前期的研究工作［1?2］亦证实补肾中药天鼓冲剂对药物性和噪声性耳聋有明显的预防和治疗效果。由此而想到除了药物治疗方法外，还有没有其它方法防治肾虚型感音神经性聋。随着高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）医学的，其所治疗的疾病已遍及临床各个学科，感音神经性耳聋即为其治疗的常见疾病之一。那么HBO是否对肾虚药物所致听觉功能损伤有干预效果呢？本实验旨在研究豚鼠肾虚时HBO对其药物所致听觉功能损伤的治疗作用，探讨HBO对肾虚耳聋的干预作用及机理，为治疗肾虚型感音神经性耳聋提供新的理论和实验依据。同时为HBO的临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物：健康、无耳疾、耳廓反射灵敏的白色红目雄性豚鼠，体重250～350g，购自中科院上海实验动物中心，标准饲料饲养于浙江中医药大学实验动物中心。主要试剂及药品：醋酸泼尼松龙注射液：0.125g/5ml，浙江仙居制药有限公司（批号：031216）；卡那霉素：0.5g/2ml，天津药业焦作有限公司（批号：031205）；主要仪器：ZEP诱发电位仪：北京中科电器高技术公司；高压氧舱：DWC400-700透明纯氧动物实验舱，上海杨园氧舱厂；LDE?2000型相差显微镜：德国COIC公司；Motic B5型生物显微镜：麦克奥迪实业集团有限公司；图像处理系统：Motic images advanced 3.0。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物及分组 选用健康活泼、无耳疾、耳廓反射灵敏的白色红目雄性豚鼠30只，体重250～350g，适应性饲养1周后随机分为3组，分别为正常对照组（正常组）、肾虚耳聋模型对照组（模型组）、肾虚耳聋高压氧治疗组（治疗组），每组各10只。标记各组动物后于安静环境下饲养。
1.2.2 动物造摸及治疗 将模型组及治疗组豚鼠按50mg/(kg·d)的剂量每日肌注醋酸泼尼松龙注射液［2］，共10d，从第6天起按400mg/(kg·d)的剂量每日肌注硫酸卡那霉素，直至第10天。将治疗组豚鼠置于2MPa透明有机玻璃纯氧动物专用实验舱内吸氧，压力0.12MPa，升压、稳压、降压时间分别为15min、25min、10min，每次总时间为50min［5］。每天1次，共10天。正常组豚鼠不作任何处理。
1.2.3 观察指标 动物分别在造模前、造模后及治疗后在隔音的电屏蔽室内用ZEP诱发电位仪进行ABR测试，测定各组豚鼠ABRⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ波的潜伏期及波间期。温室保持15～20℃。在治疗后行耳蜗基底膜铺片［6］及形态学观察，耳蜗螺旋韧带铺片［7］及血管纹观察，耳蜗琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）染色及组织化学观察［8］ 。
1.3 统计学方法 计量资料用均数±标准差（x±s）表示，用SPSS11.0软件统计包对各组数据进行统计分析。在检验方差齐性的条件下，多组间均数比较用方差分析，F检验。均数间两两比较用q检验（Newman-Keuls法）及LSD法检验。同组数据在不同时期的比较采用配对t检验。均以P＜0.05为差异显著的检验标准。
2 结果
2.1 各组豚鼠的ABR阈值 造模前，各组豚鼠正常ABR阈值无显著性差异（F＝0.04，P>0.05）。造模后，模型组及治疗组豚鼠ABR阈值明显升高（F＝107.863，P<0.01），正常组与其他两组比较，差异有显著性（P<0.01）。但模型组与治疗组比较，差异无显著性（q＝0.24，P>0.05），见表1。
2.2 各组豚鼠的ABR各波潜伏期 经q检验，三组豚鼠的ABRⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各波的潜伏期均数之间两两比较有显著性差异，模型组与治疗组各波比较P<0.05，模型组与正常组、治疗组与正常组各波比较P<0.01，见表2。
2.3 各组豚鼠ABR各波的波间期 表3、4的统计结果表明，各组豚鼠在造模后及治疗后的各波间期均无显著性差异（P>0.05）。
表1 造模前后及治疗后各组动物ABR阈值（略）
与同期模型组及治疗组比，*P<0.01 与同期治疗组比，**P>0.05；与同组造模后比，▲P>0.05 ；与同组造模后比，▲▲P<0.01
表2 各组动物治疗后ABR潜伏期的q检验（略）
表3 造模后各组动物ABR波间期（略）
表4 治疗后各组动物ABR波间期（略）
2.4 耳蜗基底膜铺片形态学观察及外毛细胞计数 40×10倍光镜观察显示模型组豚鼠（图2）的外毛细胞缺失较治疗组豚鼠（图3）严重，两组均可见听纤毛排列紊乱、倒伏、融合，内毛细胞完整。表5为各组豚鼠耳蜗基底膜第二回起始段外毛细胞的计数，结果显示外毛细胞的损失以模型组为多，方差分析（F＝146.52，P<0.01）表明差异有显著性，3组间进行两两比较均有显著性差异（P<0.01）。
表5 各组动物3个视野下外毛细胞数（x±s）及损伤率（略）
与模型组及治疗组比，*P<0.01 ；与治疗组比，▲P<0.01
2.5 耳蜗螺旋韧带铺片血管纹观察 耳蜗螺旋韧带铺片观察结果显示：正常组豚鼠（图4）螺旋韧带微血管充盈良好，管径粗细均匀，血管间有很多分支吻合成网状。模型组（图5）血管纹毛细血管管径变细、粗细不均，血管吻合支减少，血管内红细胞瘀积，部分血管出现较严重的断流现象；治疗组（图6）血管纹毛细血管收缩，呈轻度缺血，但毛细血管内未见明显红细胞瘀积现象。
2.6 耳蜗基底膜毛细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）组化反应 光镜下可观察到正常组豚鼠耳蜗基底膜铺片毛细胞SDH组化反应呈深蓝色（见图7）；模型组豚鼠耳蜗基底膜铺片显示SDH染色较正常组变淡，有的甚至消失，耳蜗外毛细胞受损明显，SDH变化显著，内毛细胞无明显损害；各回比较以底回毛细胞损害重，顶回较轻；三排外毛细胞以外两排损害重（见图8）；组豚鼠毛细胞SDH酶活性有明显恢复，但仍有部分区域着色变浅，毛细胞排列基本恢复正常，但毛细胞染色仍不均匀（见图9）。与报道基本一致［9］。
图1 正常组豚鼠基底膜铺片（40×10）（略）
图2 模型组豚鼠基底膜铺片（40×10）（略）
图3 治疗组豚鼠基底膜铺片（40×10）（略）
图4 正常组豚鼠螺旋韧带铺片（40×10）d（略）
图5 模型组豚鼠螺旋韧带铺片（40×10）（略）
图6 治疗组豚鼠螺旋韧带铺片（40×10）（略）
图7 正常组豚鼠耳蜗毛细胞SDH染色（40×10）（略）
图8 模型组豚鼠耳蜗毛细胞SDH染色（40×10）（略）
图9 治疗组豚鼠耳蜗毛细胞SDH染色（40×10）（略）
3 讨论
肾与耳的联系是多方面的，耳属肾，为肾之外窍，耳的生理功能由肾所主持。《素问·阴阳应象大论》曰：“肾主耳……在窍为耳” 。《灵枢·五阅五使篇》又说：“耳者肾之官也”。一般认为肾虚感音神经性耳聋的发生内缘于肾气亏虚、气血不足、而运血无力，血液淤积，耳窍失养，致使耳蜗局部缺血缺氧，导致微循环障碍及能量代谢异常，使组织缺血缺氧，甚至变性、坏死。复遇药毒浊邪内犯，滞而不去，上干耳窍，络脉瘀阻，而致听觉功能受损［3］。
复制肾虚模型一般采用小鼠或大鼠，利用豚鼠者尚不多见。但豚鼠耳蜗比较发达，听觉敏锐，对声音比较敏感［10］；另外，本实验的重点之一需观察耳蜗的形态学变化，小鼠或大鼠耳蜗较小，在制作标本时有一定困难，因此本实验选用豚鼠作为实验动物。该造模方法，可避免动物长时间接受致聋致虚因素的刺激，导致实验过程中动物的死亡，且肾虚状态下豚鼠更易受致聋因素的影响而致听觉功能损伤，可采用此复合方法建立肾虚耳聋模型，从而缩短造模时间。
徐根兴等［11］对小鼠耳廓微循环进行了观察，认为HBO作用机理之一是：HBO处理后微循环血流速度加快，毛细血管开放数增加，微循环单位中毛细血管密度增大，改变了微循环的功能状态，增加了局部组织的血供，促进了毛细血管内皮细胞和周围组织细胞的有氧代谢。糖的有氧氧化是在线粒体内进行，SDH是琥珀酸氧化酶系统的第一个酶，也是最重要的酶，是用于反映三羧酸循环的标志酶。有研究指出，SDH和细胞色素氧化酶可被HBO所激活，提高葡萄糖代谢率，使能量生成增多，有利于受损的细胞功能恢复。治疗组豚鼠毛细胞SDH酶活性有明显恢复，但仍有部分区域着色变浅，毛细胞排列基本恢复正常，但毛细胞染色仍不均匀，由此，可认为HBO改善听觉功能的另一机制可能是提高内耳酶活性，从而提高能量代谢，促进受损的细胞功能恢复。
从本实验结果，HBO对肾虚型药物所致听功能损伤有一定的治疗作用，但治疗组豚鼠在ABR阈值、潜伏期以及毛细胞形态、计数及酶活性等方面都只能部分恢复，与正常组相比，仍然相差较大，因而设想，如若临床采用补肾或活血化淤药物配合HBO综合治疗，随着耳蜗微循环的改善，将可能提高病变区的药物含量，增加HBO及药物的疗效，使两者起相互促进作用。
【文献】
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