茶皂素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用的研究
【摘要】目的 观察茶皂素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法 采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，以茶皂素灌胃给药，观测其对脑缺血大鼠的神经行为、脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶 (NOS)活性及一氧化氮(NO)、活性氧 (ROS)、丙二醛 (MDA)含量的影响。结果 茶皂素能明显改善脑缺血大鼠的神经行为，拮抗脑缺血再灌注引起的SOD活力的下降及ROS、MDA含量的升高，并使脑缺血大鼠的脑组织中NO及NOS水平明显下降。结论 茶皂素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤具有很好的保护作用。
【关键词】茶皂素 局灶性脑缺血 自由基 一氧化氮
【Abstract】Objective:To observe the protective effect of tea saponin on Focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods: Make focal cerebral ischemia-reperfusion model of rat by suture, delivery tea saponin by Ig.To observe the influence of tea saponin to neurobehavioral and brain superoxide dismutase (SOD), nitric oxide synthase (NOS) activity and nitric oxide (NO), reactive oxygen species (ROS), malondialdehyde (MDA) content in cerebral ischemia rats. Results:Tea saponin can improve neurobehavioral in cerebral ischemia rats obvious -ly and antagonist cerebral ischemia-reperfusion-induced decline in SOD vitality and ROS, MDA content increased and make the levels of NO and NOS decreased obviously in brain tissue of cerebral ischemia rat.Conclusion:Tea saponin can protect the rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury very well.
【Keywords】 Tea saponin Focal cerebral ischemia Free radicals Nitric oxide
茶皂素(Tea saponin：TS)是从茶树中提取的一种五环三萜类植物皂甙，由配基、糖体和有机酸三部分组成，存在于茶籽、茶叶、茶根等各个部分，具有多种生物活性。据报道[1]，茶皂素有明显抗炎、抗渗透、抗菌、化痰、止咳、镇痛等作用，而且有防止高血压、高血糖及化痰止咳的作用。目前，对茶皂素关于脑缺血再灌注损伤的研究报道较少。本实验旨在建立动物脑缺血再灌注模型，观察茶皂素对实验性大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。
1 材料
1.1茶皂素的制备[2～3] 挖取5年以上树龄的茶树根，洗净，切片，烘干，粉碎成粗粉，按料液比l：4加80%乙醇进行超声波法提取。工艺参数：超声波频率为20kHz，提取时间为20min，提取溶液温度为50℃。所得提取液经大孔吸附树脂层析、乙醇洗脱、脱色剂处理后，浓缩烘干，得到茶皂素。产品接近白色，纯度达92.8%-93.1%。在空气中放置不吸潮、不变色。
1.2试剂与仪器 R0S、SOD、MDA、NO、NOS及考马斯亮蓝试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品：SC-302超声波清洗仪（上海波龙设备有限公司），TGL-16型高速台式离心机(上海医用分析仪器厂生产)，722-型分光光度计(上海精密仪器有限公司生产)。
1.3动物 SD大鼠60只，雌雄各半，重250~300 g，由湖北省实验动物中心提供。
2 方法
2.1大鼠局灶性脑缺血模型的制备(MCAO法)[4] SD大鼠共60只，分2批，第1批用于观察神经行为；第2批用于观察脑组织SOD、NOS活力及ROS、MDA和NO含量的变化。每批分为3组，即假手术组、模型组和茶皂素组，每组10只。各组动物均于手术前灌胃给药3d，每天1次，其中茶皂素组给予茶皂素 (0.5g/kg.bw)，假手术组及模型组均灌胃给予等体积的生理盐水。第3天给药后20min，采用颈内动脉线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞 (MCAO)模型。将大鼠用20%的乌拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术台上，颈部正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，暂时夹闭颈总动脉、颈外动脉，在颈总动脉分叉下方剪一切口，将一预先用酒精灯烧成圆头的尼龙线 (直径为 0.26mm)插入颈内动脉至大脑中动脉起始端，进线深度距颈内、颈外动脉分叉处18～20 rnm左右可感到阻力，阻断右侧大脑中动脉血流。2h后抽出尼龙线，扎紧动脉残端，缝合皮肤，予以再灌注24h。假手术组大鼠麻醉后，仅暴露颈内外动脉分叉，不闭塞MCA。
2.2神经病学评分 第1批大鼠采用5分制评分标准[5]，分别于缺血再灌注后3h、6h、12h、24h进行评分。0分=无神经损伤症状；１分=不能完全伸展对侧前肢；2分=向外侧转圈；3分=向对侧倾倒；4分=不能独自行走，意识丧失。
2.3生化指标的测定 第2批大鼠再灌注24h后，处死大鼠，迅速取脑称重。用生理盐水制成10％脑组织匀浆液，低温离心，取上清液，按试剂盒说明书分别测定大脑组织中SOD、ROS、MDA及NO、NOS含量。按考马斯亮蓝法标定蛋白含量。
2.4统计学处理 实验数据采用 SPSS FOR WINDOWS 10．0软件进行 t检验统计处理。
3 结 果
3.1茶皂素对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响 造模后，连续观察3h、6h、12h、24h，进行大鼠神经功能缺损评分。与假手术组比较，各造模组在四个时间点均出现明显的神经功能缺损(P＜0.01)，有统计学意义。且茶皂素组不同时段的积分均低于模型组，在缺血再灌注3h、6h、12h茶皂素组评分降低明显(P＜0.05)，有统计学意义。
3.2茶皂素对局灶性脑缺血大鼠脑组织ROS、MDA、SOD的影响 MCAO大鼠脑组织中SOD活性较假手术组明显减少，ROS、MDA含量明显增加 (P<0.05)；与模型组比较，茶皂素组能不同程度的改善脑损伤，抑制脑组织ROS、MDA的产生，提高SOD活性，差异显著(P<0.05)。
3.3茶皂素对局灶性脑缺血大鼠脑组织NO、NOS的影响 MCAO大鼠脑组织中NO含量及NOS活性较假手术组明显增加；与模型组比较，茶皂素组能不同程度的改善脑损伤，抑制脑组织NOS的活性，减少NO的含量。
缺血性脑血管疾病是临床的常见病和多发病。近年来研究发现，脑缺血再灌注损伤与NO、氧自由基等有关。脑内NO的作用是双重性的，其既有脑保护作用，又有神经毒性作用[6]。低浓度NO由于能扩张血管、抑制血小板聚集与粘附，可使谷氨酸调控的离子通道下调，防止细胞内钙超载，因而对细胞有保护作用；但在高浓度下，NO对细胞有损伤作用[7]。本实验结果也显示，大鼠在脑缺血再灌注24h时，脑组织NO含量及NOS活性均明显升高，而茶皂素能明显降低脑缺血再灌注大鼠腩组织NO含量和NOS活性，表明茶皂素对大鼠脑缺血再灌注有保护作用。
自由基能够攻击脑细胞膜的不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，细胞膜结构受到破坏，使膜的通透性增加，从而导致组织水肿、坏死，细胞结构和功能遭到破坏。茶皂素可明显提高MCAO大鼠脑组织中SOD活性，减少脂质过氧化产物ROS、MDA的生成，表现其抗氧化特性，对保护细胞膜免受自由基的损害起着积极作用。本实验在局灶性脑缺血再灌注模型上进一步研究发现，茶皂素能有效的改善 MCAO大鼠再灌注后3h、6h、12h、24h出现的行为功能障碍及神经功能缺损，提高肌张力。
因此，我们认为茶皂素对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与其显著的抗组织自由基损伤及抗NO神经毒作用有关。
参 考 文 献
[1] 张星海，杨贤强．茶皂素性质及应用研究近况[J]．福建茶叶，2003,2．
[2] 刘昌盛，黄凤洪，夏伏建，等．超声波法提取茶皂素的工艺研究[J]．油料作物学报，2006,28(2):203-206．
[3] 唐明远，卢向阳，屈姝存，等．茶皂素制备新工艺[J]．湖南农业大学学报，2000, 2, 26(1):66.
[4] 冯亦璞，闰超华．脑缺血实验．见：张均田主编．药理空验方法(下册)．
[5] Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et a1．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats[J]．Stroke，1989；20(1)：84-91．
[6] Liplon SA,Choi YB,Pan，ZII，et a1．A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive effects of nitric oxide and related nitrosocompounds[J]．Nature，1993；364-626．
[7] 万敬枝，程梦琳，吴基良，参附注射液对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织NO、MDA含量和SOD活性的影响[J]．中国中医急诊，2004,13(6)：381-383．
