肠激安方对腹泻型肠易激综合征模型大鼠T淋巴细胞和5羟色胺的影响

                       作者：唐洪梅，黄樱华，李得堂,丘振文，阎雪

【摘要】  　　【目的】观察肠激安方对腹泻型肠易激综合征（IBS）模型大鼠T淋巴细胞水平和5?羟色胺（5?HT）分泌的影响。【方法】选用新生SD大鼠46只，随机分成正常组，模型组，肠激安方低、中、高剂量组（中药低、中、高剂量组，剂量分别为0?94、1?88、3?76g·kg-1·d-1），补脾益肠丸组（剂量为6?76g·kg-1·d-1）；采用直肠内醋酸刺激法复制肠道高敏感大鼠模型，经大鼠排便统计及肠道敏感性评估确认造模成功后，采用流式细胞术检测各组外周血CD+3、CD+4、CD+8T淋巴细胞亚群水平，采用免疫组化法观察各组大鼠肠组织5?HT阳性细胞数和免疫染色强度。【结果】模型组大鼠排便量显著增加，肠道敏感性显著升高，CD+4水平及CD+4/CD+8比值显著降低，CD+8水平显著升高，5?HT阳性细胞数及染色强度显著增加（均P＜0?01）；中药低、中、高剂量组可减少大鼠排便量（第14天），降低肠道敏感性，升高CD+4水平及CD+4/CD+S比值，降低CD+8水平，减少5?HT阳性细胞数及染色强度（均P＜0?01）。【结论】肠激安方治疗IBS的作用可能与改善细胞免疫功能和肠道敏感性，减少5?HT分泌有关。

【关键词】  肠激安方/药；肠易激综合征/中药疗法；肠易激综合征/免疫学；结肠/病理学；疾病模型，动物；大鼠

　　Abstract: ObjectiveTo observe the effect of Changji?an Prescription (CP) on T lymphocytes count and 5?hydroxytryptamine (5?HT) secretion in rats with diarrhea predominant irritable bowel syndrome (IBS). MethodsForty?six neonatal SD rats were randomized into normal group, model group, low?, middle? and high?dose CP groups (0?94, 1?88 and 3?76g·kg-1·d-1 respectively), and Bupi Yifei Pills group (6?76g·kg-1·d-1). Continuous internal rectal stimulation with acetate was used to induce the rat model of intestinal hypersensitive IBS. Flow cytometer was used for the quantitative analysis of peripheral levels of T lymphocytes subsets CD+3 , CD+4 and CD+8 , and immunohistochemical method was used to observe 5?HT?positive cells number and the immunostaining intensity in the bowels of rats .ResultsIn the model group, the defecation volume and the intestinal sensitivity were increased, CD+4 level and CD+4/CD+8 decreased, CD+8 level increased, 5?HT?positive cells number and the immunostaining intensity elevated (P＜0?01 compared with the normal group). The defecation volume 14 days after treatment and the intestinal sensitivity were decreased, CD+4 level and CD+4/CD+8 increased, CD+8 level decreased, 5?HT?positive cells number and the immunostaining intensity lowered in CP groups(P＜0?01 compared with the model group). ConclusionThe therapeutic mechanism of CP for IBS is probably related with the improvement of cellular immunity and intestinal sensitivity, and with the reduction of 5?HT secretion. 

　　Key words:CHANGJI?AN PRESCRIPTION/ pharmacology;IRRITABLE BOWEL SYNDROME /TCD therapy;IRRITABLE BOWEL SYNDROME /immunology;COLON/pathology;DISEASE MODELS, ANIMAL;RATS

　　肠激安方由痛泻要方加减组成，具有疏肝健脾、清热祛湿、行气止痛及止泻功效，主治慢性结肠炎、慢性消化不良、腹痛腹泄、胃纳不振等。肠易激综合征（IBS）是一种常见的慢性非器质性肠功能紊乱性疾病，目前认为内脏敏感性增高是IBS最重要的病理生理特征之一［1］，它是一种脑肠调节异常的疾病，受神经内分泌和免疫因素介导，并受心理社会学因素调节［2］。在受旋毛虫感染活体实验中观察到肠道平滑肌功能的改变依赖于T淋巴细胞，这一结论支持肠平滑肌功能受免疫系统调节的概念［3］。此外，T淋巴细胞在胃肠道感染后的神经肌肉功能的介质释放中也起到了关键的作用。目前对腹泻为主的IBS研究较多，5?羟色胺（5?HT）含量无论是在病人血浆中还是在结肠黏膜中均明显增高［4-5］。本实验从肠道敏感性评估、T淋巴细胞亚群、5?HT 免疫组化阳性细胞数及染色强度等角度探讨中药肠激安方的作用机制,现将结果报道如下。

　　1材料与方法

　　1?1试剂与仪器

　　石蜡油（泰兴仪器经营部）； 醋酸、乙醚（广州化学试剂厂）；T淋巴细胞亚群试剂盒（北京市晶美基因谷科技有限公司，批号：2A?0231）；5?羟色胺试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：60382304）；PV?6001 辣根酶标记羊抗兔多聚体（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：09434）。HZS?H电热恒温水浴箱（上海医疗仪器五厂）；BP211D型精密天平（Sartorius AG）；ALTRA EPICS型流式细胞仪（贝克曼库特实验系统苏州有限公司）；TDL?5?A型低速台式大容量离心机（上海安亭科学仪器厂）；MS2微型摇床（广州仪科实验技术有限公司）；TP1020型自动脱水机（莱卡公司）；EG1140H型石蜡包埋机（莱卡公司）；2255型B×50生物显微镜（莱卡公司）；HITACHI600型透射电镜（日本）。

　　1?2药物制备

　　肠激安方提取物由广州中医药大学新药开发研究中心提供（批号：20060511），加生理盐水搅拌溶解，制成0?5g/mL的肠激安药液；阳性对照药 补脾益肠丸由广州陈李济药厂生产（批号：K06087）,研碎成细粉，加生理盐水搅拌溶解后制成1g/mL的药液。

　　1?3实验动物

　　新生SD大鼠，SPF级乳鼠每8只与母鼠一起饲养，发育至24d后，将母鼠与幼鼠分离(实验用乳鼠购自广东省医学实验动物中心，合格证号：2006A010)。

　　1?4造模、分组及给药

　　将新生SD大鼠随机分为6组：正常组，模型组，肠激安方低、中、高剂量组（中药低、中、高剂量组，剂量分别为0?94、1?88、3?76g·kg-1·d-1),补脾益肠丸组(剂量为6?76g·kg-1·d-1)，每组10只。各组从第8～21天，每天给予直肠内醋酸刺激，进行内脏高敏感大鼠模型造模，正常组每天直肠内给予生理盐水。经大鼠排便统计及肠道敏感性等指标评估，腹泻型IBS模型复制成功后，在大鼠9周龄时分别灌胃给予肠激安药液高、中、低剂量及补脾益肠丸药液。正常组、模型组以等容积生理盐水灌胃。

　　1?5大鼠排便统计

　　分别于中药干预前1d，干预第7天，干预第14天，在笼内垫清洁滤纸，观察4h内大鼠排便的粪点数。实验均在白天进行。

　　1?6肠激安方对IBS模型大鼠肠道敏感性的影响［6］

　　上述新生期大鼠在刺激停止2周后，分别在第6、8周龄进行肠道敏感性评估，验证模型是否成功。评估大鼠的腹部回缩反射(AWR)：将血压计、针管与自制指套气囊用三通管连接，用针管向气囊内打气时可以在血压计上读出气囊内压力。6周龄大鼠在乙醚麻醉下，把用石蜡油润滑后的气囊经肛门插入约5cm，用胶布把导管和大鼠尾根部缠在一起，固定气囊。大鼠苏醒后，将其放在自制的透明玻璃笼内，大鼠在此笼内不能转身。15min后待大鼠适应环境，逐渐打气扩张肠道，分别测定引起大鼠腹部抬起以及背部拱起的压力阈值（mmHg），进行行为评估。为得到准确的评估结果，对每一阈值都重复进行3次扩张，数据取均值。在第8周再测1次，比较正常组与模型组压力阈值的统计学差异。造模成功后，从9周龄开始给药治疗，每日灌胃1次，共2周。治疗后再次进行肠道敏感性评估。

　　1?7CD+3 、CD+4、CD+8T淋巴细胞亚群水平的检测方法
　　将末次给药后的大鼠乙醚麻醉，眶静脉采血0?5～1mL置乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝管中，取50μLEDTA抗凝血，加入5μL荧光素标记的单克隆抗体，混匀，避光孵育30min；加入溶血素1mL混匀，避光孵育10～15min，至液体澄清透明，1 000r/min离心5min，弃去上清液；加入1mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗液混匀，1 000r/min离心5min，弃去上清液；将细胞悬浮于0?5mL PBS洗液中，振荡混匀后采用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群水平。

　　1?8光镜观察大鼠肠组织5?HT分泌情况

　　将眶静脉采血后的大鼠脱颈椎处死，取其距肛门10cm处的降结肠2段，每段约2cm，其中一段进行免疫组化染色：采用体积分数10%福尔马林固定，常规包埋，脱蜡、水化组织切片，切片经纯二甲苯脱蜡2次，每次6～8min，梯度酒精脱二甲苯各2min，自来水冲洗、PBS漂洗各3次，每次2min。体积分数3%的H2O2阻断内源性过氧化物，PBS冲洗后，滴加5?HT抗体孵育30～60min，PBS冲洗3次，每次2min。滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体，室温孵育20min，PBS冲洗3次，每次2min。用二氨基联苯胺（DAB）溶液显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。随后在光镜下观察，随机选择连续的肠腺腔300个细胞，并其中免疫阳性反应细胞个数，统计数量,以每100个细胞中所含阳性细胞数表示结果。并对每张切片染色强度进行评估：0度：无染色信号 ；1度：染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以下；2度： 染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以上，或染色信号呈粗颗粒状、块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50%以下；3度：染色信号呈粗颗粒状或块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50%以上。

　　1?9统计学方法

　　实验数据采用SPSS11?5软件进行统计。

　　2结果

　　2?1肠激安方对大鼠排便情况的影响

　　表1结果显示，模型组粪点数与正常组比较差异有显著性意义(P＜0?01)，表明大鼠排便次数明显增多，腹泻情况持续存在；第14天时，中药低、中、高剂量组及补脾益肠丸组与正常组粪点数比较差异无显著性意义（P＞0?05），与模型组比较差异有显著性意义（P＜0?01），表明各给药组对腹泻排便情况具有明显改善作用。表1肠激安方对大鼠排便情况的影响（略）

　　2?2肠激安方对IBS模型大鼠肠道敏感性的影响

　　表2结果显示，模型组动物在造模后的第6周和第8周,其抬腹和拱背的压力阈值均低于正常组(P＜0?01) ，说明其肠道敏感性显著升高。经过药物治疗后（第10周），中药中、高剂量组及补脾益肠丸组大鼠抬腹和拱背的压力阈值与正常组比较无显著性差异（P＞0?05），与模型组比较差异有显著性意义(P＜0?01)，提示肠激安方能明显改善模型所致的肠道敏感性异常。表2各组大鼠不同时期肠道敏感性评估（略）
　
　　2?3各组CD+3 、CD+4、CD+8T淋巴细胞亚群水平变化与正常组比较

　　各组的CD+3水平差异无显著性意义（P＞0?05），模型组CD+4细胞水平较正常组显著降低，而CD+8细胞水平则显著升高，CD+4/CD+8比值显著下降（均P＜0?01）；与模型组比较，中药低、中、高剂量组CD+4、CD+8水平和CD+4/CD+8比值差异均有显著性意义（P＜0?01）。说明用药2周后，大鼠机体的细胞免疫功能有所改善，逐渐恢复到正常水平。结果见表3。表3各组CD+3 、CD+4、CD+8 T淋巴细胞亚群水平变化比较（略）

　　2?4各级大鼠肠组织的5?HT免疫染色病理切片观察结果
　　
　　连续观察各组标本的300个细胞均可见5?HT免疫染色阳性细胞，此类细胞多分布在肠腺腔基底部，以肠腺隐窝部位较多。模型组免疫组化染色阳性细胞体积较大，大多为锥形或圆形，染色强度较强（图1-b，彩图见第200页）；正常组、各给药组免疫组化染色阳性细胞体积较小，多为圆形，染色强度较弱（图1-a、c、d、e、f，彩图见第200页)。与正常组比较，模型组5?HT阳性细胞数显著增多，免疫组化染色强度显著增强(均P＜0?01)；中药低、中、高剂量组及补脾益肠丸组的阳性细胞数和染色强度与正常组比较差异无显著性意义（P＞0?05）,与模型组比较5?HT阳性细胞数显著减少，免疫组化染色强度显著降低(均P＜0?01) ，说明肠激安方能改善IBS模型大鼠5?HT分泌增多的情况。结果见表4。表4各组5?HT阳性细胞数与免疫组化染色强度比较（略）

　　3讨论

　　目前已建立的与IBS相关的动物模型较多，但大多是根据体外单因素建立的符合IBS某一方面的病理生理机制的动物模型，而病证结合模型未见报道。情志因素与IBS症状的发作和加重有关，且情志所伤多引起肝郁。本实验选用的模型虽然是由化学炎症刺激引起，但由于刺激处在乳鼠期，属于早期生活事件引起的动物模型，因此这类剌激对乳鼠也是一种情志因素刺激。其症状发生的直接机理是基于肠道高敏感性和高反应性基础上的肠道运动功能异常。本实验结果显示，模型组动物在造模后的第6周和第8周，其抬腹和拱背的压力阈值均明显低于正常组，说明其肠道敏感性显著升高。经过药物治疗后，肠道敏感性压力阈值明显高于模型组，说明肠激安方药液能改善IBS模型大鼠的肠道敏感性，并使其恢复正常。外周血T细胞亚群在数量上的协调比例，特别是CD+4/CD+8比值更有助于反映机体免疫反应的调节能力［7］。有研究表明，IBS的不同亚型之间，CD+4/CD+8比值存在相反的状态：腹泻型组和交替型组比值下降，便秘型组比值增高［8］，本实验中发现模型组CD+4/CD+8比值显著下降，提示本研究的IBS模型具有腹泻型IBS的细胞免疫特征。IBS虽为功能性疾病，但仍存在体内免疫异常的情况，同时CD+4 、CD+8的细胞均值及CD+4/CD+8比值可以作为判断IBS病情的指标。本研究通过检测大鼠外周血中CD+3、CD+4、CD+8水平，发现模型组CD+4细胞水平较正常组显著降低，而CD+8细胞水平则显著升高，致CD+4/CD+8比值显著下降，因此可以认为腹泻型IBS存在着免疫异常，推测外周血T淋巴细胞亚群的改变可能影响了细胞因子的变化，从而导致了腹泻型IBS患者的腹痛腹泻等症状的产生。中药低、中、高剂量组及补脾益肠丸组CD+8和CD+4/CD+8的水平与正常组比较均无显著性差异，说明用药2周后，大鼠机体的细胞免疫功能有所改善并逐渐恢复。5?HT是一种广泛存在于神经系统和胃肠道的神经递质，参与了心理和神经功能的调节。研究表明IBS患者血浆和结肠组织5?HT含量升高［9-10］； 5?HT的异常升高会导致肠道动力异常和内脏感觉过敏，也是引起腹泻的重要物质［11］，提示肠道5?HT和IBS患病关系密切。本实验结果显示，模型组动物结肠组织分泌的5?HT免疫组化染色阳性细胞明显多于正常组，5?HT染色明显加深；各治疗组均能不同程度地减少5?HT免疫组化染色阳性细胞的数量，且5?HT染色变浅。表明肠激安方能降低IBS模型大鼠分泌增多的5?HT，改善因5?HT的异常升高而导致的肠道动力异常和内脏感觉过敏，改善腹泻症状。本研究结果表明，肠激安方治疗IBS的作用可能与改善细胞免疫功能和肠道敏感性，减少5?HT分泌有关，其确切机制有待进一步研究。

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