疏肝祛淤方对兔膝早中期骨性关节炎软骨的影响
作者：黄肖华 段戡, 朱少廷, 张锡流, 袁长深 郝华
【摘要】 目的探讨以“疏肝郁、祛膝淤”为原则组方的膝舒汤对膝早中期骨性关节炎软骨的影响机理。方法选择成年健康日本大耳白兔30只，雌雄不限，体重2.5～3.0 kg，随机分出未造模10只为正常组，20只通过结扎股静脉造膜8周后随机分为模型组和中药组，每组10只。中药治疗组以膝舒汤灌胃，模型组以生理盐水灌胃。于实验开始后10，12周两个时相过量麻醉处死，每组每批各5只。打开关节腔进行关节软骨大体观察，然后切取股骨髁下面全层关节软骨，行软骨的组织学观察 。结果中药治疗2周软骨恢复明显，与模型组2周相比明显改善（P＜0.01），但与正常组同时期相比软骨修复未接近正常（P＜0.01）；中药治疗4周软骨修复显著，与生理盐水对照4周相比明显改善（P＜0.01），与正常组同时期相比软骨修复接近正常（P＞0.05）。结论以“疏肝郁、祛膝淤”为原则组方的膝舒汤能明显促进软骨的修复，使软骨层次恢复正常，细胞核浓缩得以恢复，软骨陷窝结构恢复清晰。
【关键词】 膝； 骨性关节炎； 中医药疗法； 软骨； 膝舒汤
膝骨性关节炎（Knee osteroarthritis KOA ）是一种多发于老年人的慢性进行性骨关节疾病，主要病变为膝关节软骨退行性变和继发性骨质增生，本病晚期治疗效果不佳，给患者的生活质量带来极大的影响，故早中期的治疗显得尤为重要。根据全国名老中医朱少廷教授的经验，作者在临床实践中应用以“疏肝郁、祛膝淤”原则组方的膝舒汤（组成：柴胡、当归、白芍、茯苓、丹皮、羌活、防风、桃仁、红花、牛膝、木瓜、蜈蚣等）治疗中老年骨性关节炎，取得良好疗效［1］。为进一步探讨本治法的作用机理进行此实验研究。实验采用结扎兔股静脉造成骨内高压，从而造成兔膝早中期骨性关节炎模型，观察膝舒汤对兔膝早中期骨性关节炎的疗效，探讨其治疗机制。
1 材料
1.1 动物成年健康日本大耳白兔30只，雌雄不限，体重2.5～3.0 kg，由广西中医学院动物实验中心提供。
1.2 药品膝舒汤浓缩液：纯中药制剂，主要组成：柴胡、当归、白芍、茯苓、丹皮、羌活、防风、桃仁、红花、牛膝、木瓜、蜈蚣等。由广西中医学院第一附属制剂室提供，每10 ml相当生药12 g。生理盐水，广西南宁百会药业集团有限公司生产，批号0608012。青霉素钠，华北制药股份有限公司生产，批号X0601318。20%乌拉坦，医药集团上海化学试剂公司，批号20031216。
1.3 仪器切开包，灌胃器，切片机，显微光镜，组织脱水机，组织包埋机， 漂烘处理仪，恒温培养箱，石蜡切片机， Olympus 摄影显微镜 ， Olympus CH-2 光学显微镜等。
2 方法
2.1 动物分组 日本大耳白兔30只，随机分出未造模10只为正常组，20只造模8周后随机分为模型组和中药治疗组，每组10只。
2.2 造模原理 结扎股静脉，造成静脉瘀滞，骨内压升高，使其形成膝早中期骨关节炎模型。
2.3 造模方法 20%乌拉坦4 ml/kg体重，行耳缘静脉麻醉。将大耳白兔仰卧固定在兔台上，以右腹股沟中点以下约1.0 cm为中心，作0.5 cm的纵行切口，分离股静脉，分别在远、近端双重结扎股静脉，在两道结扎线间将股静脉剪断，逐层缝合皮下组织及皮肤。术后青霉素肌注抗炎3 d，分笼饲养，1周后拆线。造模8周后开始治疗。
2.4 给药 根据Meeh-Rubner公式兔的给药剂量，中药治疗组予膝舒汤，1剂/d，相当于生药12 g·kg-1·d-1，配成30 ml，分早晚两次灌胃；模型组给予生理盐水30 ml，分早晚两次灌胃。
2.5 取材 于实验开始后10，12周分批予过量麻醉处死，每组每批各5只。打开关节腔进行大体观察。然后切取股骨髁下面全层关节软骨。
2.6 病理切片制作及染色 石蜡切片制作：取材后的标本经4 %多聚甲醛溶液固定24～48 h，递增浓度乙醇脱水，石蜡包埋，间断连续切片（切片方向：与软骨表面垂直），厚3 μm。苏木精-伊红(HE)染色，光镜下组织学观察。
2.7 结果评分股骨髁下面关节软骨组织学观察采用Mankin评分［2］。
2.8 统计学处理所有实验数据采用SPPS10.0软件进行分析，以±s表示，采用t检验。
3 结果
3.1 关节软骨大体观察正常组：两个时相取材时观察白兔关节软骨外观均呈淡蓝色，色泽明亮，边缘规整，无裂纹及软化。模型对照组：第1次取材，白兔关节软骨失去原有光泽，变暗淡，触之较软，滑膜稍充血，轻度增生，粘连轻；第2次取材，白兔关节软骨失去原有光泽，变暗，触之软，滑膜充血轻，增生不明显，粘连轻。中药治疗组：第1次取材时关节软骨有光泽，色淡，触之稍软，滑膜无充血，轻度增生，粘连轻；第2次取材时观察白兔关节软骨外观呈淡蓝色，色泽亮，边缘规整，无裂纹。
3.2 关节软骨病评价见表1～2。
表1 实验开始8周后继续以下处理2周的结果及Mankin评分值（略）
中药（灌服2周）组与生理盐水（灌服2周）模型对照组比较，P＜0.01，与正常组比较，P＜0.01；n=5
表2 实验开始8周后继续以下处理4周的结果及Mankin评分值（略）
中药（灌服4周）治疗组与生理盐水（灌服4周）模型对照组比较，P＜0.01，与未造模空白组比较，P＞0.05；n=5
中药灌服2周软骨恢复明显，与模型生理盐水灌服2周相比明显改善，P＜ 0.01，说明两组间有显著性差异；但与正常组同时期相比软骨修复未接近正常，P＜0.01，说明两组间有显著性差异。
中药灌服4周软骨修复显著，表层软骨细胞多，软骨面平整，层次清晰，潮线清楚明显，软骨细胞馅窝清晰，细胞饱满，细胞核大，胞浆丰富，基质呈酸性（见图1）。模型组生理盐水灌服4周，软骨表面有破坏，凹凸不平，表层软骨细胞少，细胞层次不清，软骨细胞馅窝不清晰，胞浆少，基质偏碱性（见图2）。正常组表层软骨细胞多，排列均匀，软骨面平整，层次清晰，软骨细胞馅窝不清晰，细胞饱满，细胞核大，胞浆丰富，基质偏碱性（见图3）。中药灌服4周与模型组生理盐水灌服4周相比软骨明显改善（P＜0.01），说明两组间有显著性差异；与未造模正常组同时期相比软骨修复接近正常（P＞0.05），说明两组间无显著性差异。
图1 中药治疗组（200×）（略）
图2 生理盐水对照组（200×）（略）
图3 正常组（200×）（略）
4 讨论
4.1 血淤、骨内压与骨性关节炎的关系 在临床中常见的股骨头缺血坏死、腕舟骨缺血坏死、距骨缺血坏死，都会导致软骨退变、缺损，由此可认识到软骨下骨的血运状况对软骨的退行变性产生重要影响。1972年Arnoldi等［3］认为骨内静脉淤滞可使骨内压升高，并引起膝关节疼痛。此后国内外的研究也证实了骨内压升高是骨性关节炎中的一个重要病因、病理环节，常出现在骨性关节炎的早中期。骨内压升高会影响软骨的营养、修复、软骨细胞的增殖，而任何使骨内血液淤滞的因素都可引起骨内压升高，从而出现骨性关节炎。因此阻止骨内高压的产生、和降低骨内高压的治疗对骨性关节炎的预防和治疗有重要的意义。本实验通过结扎股静脉造成膝关节骨外静脉淤滞从而导致骨内静脉淤滞，骨内血液流变学发生改变， 造成骨内压升高，造成兔膝关节早中期以“膝淤”为特点的骨性关节炎模型，然后以“疏肝郁、祛膝淤”为原则组方的膝舒汤进行治疗，从实验结果分析，本治法能明显促进软骨的修复，使软骨层次恢复正常，细胞核浓缩得以恢复，软骨陷窝结构恢复清晰，从而达到治疗骨性关节炎的目的。因而我们认为本治疗方法能祛除膝部静脉淤滞，从而降低骨内压，促进软骨的修复，对防治早中期骨性关节炎有较好的疗效。
4.2 以“疏肝郁、祛膝淤”为原则组方的膝舒汤治疗膝关节骨性关节炎的认识 膝关节骨性关节炎属祖国传统医学“痹证”范畴。膝部筋骨血脉受损，气血淤滞，出现以淤为主要病机的早中期骨性关节炎。而膝为筋之府，肝主筋，筋之府（即膝）气血不畅，则筋之主（即肝）反受其制，而致气机不畅。根据“治病必求于本”的原则，从肝主筋出发，与疏肝理气法结合，祛膝淤为根本，组方从逍遥散化裁而来用药。方中柴胡、当归、白芍取其疏肝解郁之功，茯苓、丹皮取其利水消肿之力，羌活、防风经祛风而利水消肿，桃仁、红花经牛膝、木瓜引经入络而去膝部淤血，蜈蚣入肝经，擅于去深部淤滞所致之顽痛，诸药合用，共达疏肝郁、去膝淤，消肿止痛之功。
4.3 本造模方法与骨性关节炎的关系本实验结扎股静脉是采用关节外手术途径造模，对关节无直接损伤，无直接手术操作损伤引起的滑膜炎症影响。本造模手术简单，容易操作。结扎股静脉后未行石膏固定造模的膝关节，目的是在造成静脉淤滞骨内压升高后，保持膝关节适当的活动，使其形成的骨关节炎模型更接近临床老年骨关节炎形成过程，而非与急性创伤性骨关节损伤后制动出现的骨关节炎相似。本实验中生理盐水对照组Mankin评分在两个取材阶段均为早中期表现，因而本造模方法不适用于骨关节炎晚期的造模。
【】
［1］ 黄肖华，朱少廷.疏肝祛瘀法治疗膝骨性关节炎临床观察［J］.中医正骨，2006,18(3):223.
［2］ 葛广勇，赵建宁，刘 刚.膝骨性关节炎模型的分期特征［J］.临床康复，2006，10(4)：47.
［3］ 金成文，陆洪英，刘跃春.影响家兔胫骨上端骨内压的因素［J］.山东生物医学工程,2000,19(1):48
