P物质对大鼠垂体前叶细胞游离Ca2+影响的研究
【摘要】 目的：探讨SP是否影响培养的大鼠AP细胞［Ca2+］i，在第二信使信息转导途径上进一步阐述SP产生生物学效应的机制。方法：原代培养成年雌性S-D大鼠的AP细胞48h，加入SP孵育不同时间，采用Fura-2/AM检测［Ca2+］i。结果：当SP浓度为100nmol/L，孵育时间由10min增加到30min时［Ca2+］i增加，但孵育时间为40min、50min时，［Ca2+］i呈现减少趋势，即最大反应的孵育时间为30min。当孵育时间为20min、30min、40min、50min时，［Ca2+］i分别为211±16nmol/L、369±51nmol/L、358±24nmol/L、239±36 nmol/L，与10min（117±17nmol/L）相比较，呈显著性差异(P＜0.05)。结论：通过Fura-2/AM可精确反映［Ca2+］i, SP兴奋AP细胞SPR后可通过Ca2+来完成其部分的生物学效应，说明了SP对生殖轴（下丘脑-垂体前叶-卵巢/睾丸）有调控作用。
【关键词】 P物质 Ca2+ 垂体前叶 Fura-2/AM
P物质（SP）通过垂体前叶（AP）的P物质受体（SPR）产生作用。作为第二信使的钙离子可调控细胞内许多生理功能，如肌肉收缩、凝血过程、AP、神经冲动、分泌功能等。但SP作用于AP细胞其［Ca2+］i是否有变化的研究却很少，尤其是SP对下丘脑-垂体-性腺轴的调控机理尚不十分清楚。Fura-2/AM是80年代发现的第二代荧光探针, 是目前被公认测量［Ca2+］i的一个良好指示剂，因此，本实验利用Fura-2/AM 对培养的大鼠 AP细胞的［Ca2+］i进行检测，探讨SP的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验试剂
DMEM:美国GIBCO公司；胎牛血清：天津生物技术公司；1：250胰蛋白酶：美国Amresco公司；SP：美国Sigma公司；Fura-2/AM：美国Sigma公司；粉剂,用DMSO 溶解稀释成1mmol/ L , 储存于冰箱内备用。
1.2 实验方法
1.2.1 AP细胞培养 成年雌性大鼠24只，体重230～260g,于间情期清醒状态下断头，无菌取出AP，剪成碎块，加0.25% 胰酶消化25min，两次，过钢网，离心弃上清，加DMEM使细胞悬垂并分散，进行细胞计数，调整细胞密度至1×106个细胞/ml，制成细胞悬液，将悬液接种到24孔培养板中，1ml/孔，孵育48h。
1.2.2 加入SP 实验中设立：①组为空白对照组（3孔），每孔加入1ml KHB缓冲液。②组为SP组（15孔，3孔为一时间段组），每组加入1ml KHB和100nmol/L SP的混合液孵育，调整孵育时间为10min、20min、30min、40min、50min，以10min组为对照组。
1.2.3 Fura-2/AM 负载 各组孵育完毕后加入含5μmol/L Fura-2/AM，0.2 % 小牛血清的KHB缓冲液1ml温孵40min ，弃缓冲液，用KHB缓冲液冲洗2～3 次，置于自制浴槽中，在倒置显微镜下观察荧光强度。
1.2.4 ［Ca2+］i的测定 采用阳离子测定系统和软件分析系统, 测定加SP前后单个AP细胞内钙离子荧光强度的变化。激发光波长分别为340nm 和380nm，发射波长为505nm，由下列公式胞内［Ca2+］i ,［Ca2+］i = Kd×( Sf2/ Sb2 )×［(R - Rmin)/(Rmax - R)］。式中Kd生理条件下为224nmol/L；R 是实验观察到的荧光比值( F340/ F380)；Rmax 是胞内Fura-2/AM 全部为Ca2+饱和时的荧光比值, 通过加入钙离子释放剂Ionomycin 20μmol/L测得；Rmin为Fura-2/AM 完全游离，未与Ca2+结合时的荧光比值, 通过加入EGTA 20mmol/L 测得；Sf2/ Sb2则为Fura-2/AM 在无Ca2+以及与Ca2+结合达饱和状态时，Fura-2/AM 在380nm 处的荧光强度。细胞的自发荧光在没有负载Fura-2/AM 时测定，计算Ca2+浓度之前减去细胞自发荧光和背景荧光。
1.3 统计学处理
数据以均值±标准差（x±s ）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异显著性指标，P＜0.01为差异极显著性指标。
2 结果
当SP浓度为100nmol/L，孵育时间为10min、20min、30min时，［Ca2+］i随着时间的增加而升高；而孵育时间增加到40min、50min时，［Ca2+］i呈现减少趋势。孵育时间为10min时［Ca2+］i为117±17nmol/L，其他孵育时间与之相比较，呈显著性差异(P＜0.05)。测定结果见表1。
表1 孵育时间与［Ca2+］i变化的关系（略）
注：与10min组比较，* P＜0.05, * * P＜0.01。
3 讨论
20世纪80年代Berridge等人向装有胰脏细胞的介质中加入IP3时，测得Ca2+从胞内Ca2+库中释放出来，从而证明肌醇磷脂的分解产物IP3具有第二信使的功能，启动胞内Ca2+信号系统，继而激发一系列生理反应［1］。
钙离子广泛存在于细胞内、外液,具有重要的生理功能。细胞内Ca2+分为结合钙和游离钙两种，离子化钙是胞浆中唯一的生理活性形式，它可以参与突触神经递质的释放、肌肉的收缩、血液的凝固、蛋白的合成、分布和代谢及细胞内外许多酶的激活等等。细胞内的钙离子主要贮存于线粒体和内质网内。细胞外液中的钙离子浓度远高于细胞内液,如:神经细胞在静息状态下细胞内游离钙离子浓度为10-8～10-7 mol/ L 。细胞外浓度为10-4～10-3mol/ L ，正是这种显著的浓度差成为Ca2+发挥第二信使作用的生理基础。这种浓度差是依靠细胞膜的钙离子通道的选择性及钙离子泵的作用和细胞内钙离子库(线粒体、内质网) 对钙离子的摄取与储存来维持的。细胞膜主要有两种钙离子通道: ① 电压门控式钙离子通道。可分为L、N、T 3种亚型,其中L 型通道受钙通道兴奋剂和拮抗剂的调节；②受体敏感性钙离子通道。此通道在细胞内、外钙离子的交换中不起主要作用［2］。
目前直接测定［Ca2+］i 的方法有多种, 但一些方法用于测定静息［Ca2+］i 却不太适合。Fura-2/AM作为新一代荧光探针具有荧光强度高、选择性强、双波长激发等无可比拟的优点。阳离子测定系统是一为荧光法测定活细胞内游离钙、镁等阳离子而专门设计的仪器，具有一定的准确性和可靠性。Fura-2/AM 与Ca2+结合后, 激发光谱峰值从380nm 到340nm 有较大的漂移, 用这两个光谱的荧光比值作为指标, 运用阳离子测定系统及软件分析系统, 能检测细胞内的游离钙离子浓度, 并可对［Ca2+］i 的变化进行动态观察。
本实验采用离体AP细胞培养技术、应用Fura-2/AM 作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的大鼠垂体前叶细胞, 结合阳离子测定系统检测垂体前叶细胞［Ca2+］i，结果发现：当SP的浓度为100nmol/L，孵育时间为10min、20min、30min时，［Ca2+］i随着时间的增加而升高，在30min时AP细胞内［Ca2+］i达到峰值，但随着孵育时间进一步延长时，［Ca2+］i反而呈现减少趋势，且孵育时间越长减少越明显。
已证明，SP与SPR结合后可使原代培养的成年雌性间情期S-D大鼠AP细胞内的一磷酸肌醇含量增高,从而推论出三磷酸肌醇（IP3）的含量也增加［3］。当SP作用于SPR后结合GTP激活G-蛋白，然后激活PLC使PIP2水解，生成两个信号传递途径即IP3/Ca2+和DG/PKC途径［4，5］。IP3使 Ca2+从内质网中进入胞浆,导致胞浆中Ca2+浓度增加；DG能特异性激活PKC，使细胞外的Ca2+流入细胞内，这两种来源的Ca2+与细胞内的钙调蛋白(GaM)结合后,可激活蛋白激酶,促进蛋白质磷酸化,从而调节细胞的功能活动。一个细胞表面可被结合的SPR的数量是有限的［6，7］。随着孵育时间的延长，SP将逐渐占据可被结合的SPR分子，产生的［Ca2+］i量亦随之逐渐增多，本实验结果表明当孵育时间为 30min时，可被结合的SPR量达到最大，此时［Ca2+］i的产生量也达最高峰，此后虽延长孵育时间，但因没有可被结合的SPR而使［Ca2+］i的含量不再继续增加，甚至因生成的IP3的降解（IP3逐一脱磷酸最终生成肌醇）而有所降低。本实验结果提示：SP使原代培养的成年雌性间情期S-D大鼠AP细胞内的［Ca2+］i增高,说明兴奋AP细胞SPR后可通过Ca2+来完成其部分的生物学效应，说明了SP对生殖轴（下丘脑-垂体前叶-卵巢/睾丸）有调控作用。
【】
1 Berridge MJ. Inositol triphosphate and calcium signaling. Nature, 1986, 361(28): 315～325.
2 Henriksen JS, Saermark T, Vilhardt H, et al. Tachykinins induce secretion of prolactin from perifused rat anterior pituitary cells by interactions with two different binding sites. J Receptor Signal Transduc Res, 1995, 15: 529～541.
3 于洋,姜岩,常志杰，等.P物质对培养的大鼠垂体前叶细胞IP3含量的影响.应用生物学杂志，2004，20(1):36～37.
4 孙大业，郭艳林，马力耕. 细胞信号转导. 第3版. 北京：出版社，2001.
5 Ramirez I, et al. Role of heterotrimeric G-proteins in epidermal growth factor signaling. Cellular Signaling, 1995, 7(4): 303～311.
6 Aamir M, Khawaja AM, Duncan F. Tachykinins: receptor to effecter. Int J Biochem Cell Biol,1996,28(7):721～738.
7 Jessop DS, Renshaw D, Larsen PJ, et al. Substance P is involved in terminating the hypothalamo-pituitary-adrenal axis response to acute stress through centrally located neurokinin-1 receptors. Stress,2000,3(3):209～220.
