3-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞及PTEN基因的影响
作者：曾靖, 宋涛，黄志华，肖海，黄真
【摘要】 目的通过观察3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞（PC-3）增殖和相关基因表达的影响，探讨预防前列腺癌发病的新药物。方法将PC-3在F12培养基(含10％小牛血清)中采用开放式单层贴壁培养，实验设溶剂对照组、受试物各6个剂量组，采用MTT法对PC-3的增殖情况进行分析，对3'-大豆苷元磺酸钠作用后的雄激素非依赖型前列腺癌（PC-3）细胞的存活率、细胞毒作用进行了研究。结果与双蒸水对照组相比，3'-大豆苷元磺酸钠对PC-3细胞抑制效应具有剂量依赖性，具有诱导前列腺癌细胞（PC-3）凋亡和引起坏死效应，同时诱导PC-3细胞的(PTEN基因)表达。结论3'-大豆苷元磺酸钠具有明显抑制前列腺癌细胞PC-3增殖效应，并呈剂量依赖性。
【关键词】 3'-大豆苷元磺酸钠 PC-3细胞 PTEN基因
前列腺癌是一种同性激素相关的浸润性较强的男性恶性肿瘤，其发病率和死亡率都很高。前列腺癌在转化为非激素依赖性前列腺癌后，无有效的方法。因此寻找有效、安全的预防措施已成为一个急待解决的世界性公共卫生问题。在前列腺癌发病和治疗的机制研究中，PTEN(phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen)基因引起了广泛的注意，PTEN是新发现的位于染色体10q23.3，具有酪氨酸磷酸酶活性的抑癌基因，目前认为PTEN基因及其调节的Akt通路在前列腺癌的预防和治疗中具有重要作用［1］。3'-大豆苷元磺酸钠(3'-daidzein sulfonate sodium，DSS)是中药葛根的主要有效成分大豆苷元进行结构修饰和改性的新合成的强水溶性物质［2］，化学结构式见图1。
3'-大豆苷元磺酸钠的前体物大豆苷元具有明显的抑制前列腺癌的作用［3,4］。但由于大豆苷元不溶于水，在临床中存在着生物利用度低、服用量大和显效慢等缺点。而3'-大豆苷元磺酸钠是大豆苷元进行结构修饰和改性的新的化合物，水溶性强。为寻找更好的治疗和预防前列腺癌发病的药物，我们对3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌细胞（PC-3）增殖和PTEN基因表达的影响进行研究探讨。
1 材料
F-12培养基；胎牛血清(Gibco)；噻唑蓝(MTT，Sigma)；Trizol和RT-PCR试剂盒(Invitrogen)。CO2培养箱(REVCO HABITATT )；倒置显微镜(OLYMPUS)；酶标仪(BIO-TEK．Microplate Autoreader EL309)。
2 方法
2.1 细胞培养PC-3购于中科院上海细胞生物学研究所细胞库，常规培养。
2.2 储备液和工作液将3'-大豆苷元磺酸钠用双蒸水溶解，制成0.1mol/L的储备液，-20℃保存。储备液分别溶于培养液中制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6mol/L的工作液。
2.3 MTT实验细胞于常规条件下，使用上述浓度的3'-大豆苷元磺酸钠进行处理，进行MTT实验。根据公式分别：细胞存活率（%）=实验组吸光度/对照组×100％；抑制率（%）=（双蒸水对照组—实验组）/双蒸水对照组×100％。
2.4 RT—PCR分析PTEN基因的表达PC-3细胞终止培养，移去培养基，以0.01 M PBS（磷酸盐缓冲溶液）（pH 7.4）漂洗一遍，移去PBS，加入1 ml Trizol试剂，室温下用吸管轻吹打，使细胞裂解完全。分别转入1.5 ml微量离心管中，作好标记，提取总RNA。对RNA抽提进行逆转录并进行PCR扩增，以94℃变性30 S，57 ℃退火30 S，72 ℃延伸1 min，扩增35个循环，PTEN的特异性引物：sense 5'-ACAGCCATCAT CAAAGAGATCG-3' 和antisense 5'-CACCACACACAGGTATCGGC-3'，扩增产物的长度为750 bp。β-actin（β-肌动蛋白）作为内参基因，反应结束后取扩增产物电泳，进行扫描成像。
3 结果
3.1 3'-大豆苷元磺酸钠对前列腺癌PC-3细胞存活率的影响由表1和图2可以看到，3'-大豆苷元磺酸钠对雄激素非依赖型前列腺癌PC-3细胞有一定作用，并呈现剂量依赖效应。在24 h 10-2mol/L的浓度时，3'-大豆苷元磺酸钠作用PC-3细胞抑制率为22.11％，细胞的存活率为77.89%;10-1mol/L的浓度时，3'-大豆苷元磺酸钠作用PC-3细胞的抑制率为22.25％，细胞的存活率为77.75%。
表1 MTT法测定3'-大豆苷元磺酸钠对PC-3增殖的影响（略）
3.2 对PTEN基因表达的影响实验使用不同浓度3'?大豆苷元磺酸钠对PC?3细胞进行处理（见图3），PC?3对照组，PTEN基因没有表达，不同剂量3'-大豆苷元磺酸钠处理的PC-3细胞，PTEN基因出现表达。
4 讨论
大豆苷元作为降低前列腺癌发病率的一个重要因子已得到广泛的关注，但是大豆苷元不溶于水，在临床中存在着生物利用度低、服用量大和显效慢等缺点，所以实验中我们选用经大豆苷元结构修饰了的3'-大豆苷元磺酸钠同时进行研究。本实验MTT细胞毒性实验结果发现3'-大豆苷元磺酸钠对PC-3细胞的增殖和细胞存活率具有抑制作用，并呈现剂量依赖效应。
为进一步阐明其分子机制，本次实验对抑癌基因PTEN进行了研究。研究表明，PC-3对照组，PTEN基因没有表达；而不同剂量3'-大豆苷元磺酸钠处理的PC-3细胞，PTEN基因出现表达。结合MIT、PTEN基因表达的实验结果，我们认为，由于3'-大豆苷元磺酸钠对PC-3细胞具有剂量依赖性的抑制效应，从药品研发和生物利用度的角度考虑，3'-大豆苷元磺酸钠可能会具有更好的市场应用前景。其中PTEN基因的表达与否是一个非常关键的因素。
【】
［1］Laura S，Ramon P．PTEN：Life as a Tumor Suppressor Experimental［J］．Cell Res,2001,264：29.
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