单核细胞趋化蛋白１在牙髓中的免疫组化研究

　　关键词 单核细胞趋化蛋白1 牙髓炎 免疫组化?

　　论文摘要 目的：探讨单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）在牙髓炎发生、中的作用机理，为揭示MCP-1对牙髓炎性疾病发生、发展的作用提供依据。方法：采用免疫组织化学方法检测正常人及急、慢性牙髓炎患者牙髓组织中MCP-1的表达。结果：MCP-1在正常牙髓组织中无表达，在炎症组织中有不同程度的表达。? 
　　 　　 
　　资料与方法? 
　　 
　　检测标本来自长春市口腔2004年3～9月口腔内科门诊患者，急、慢性牙髓炎各20例，健康牙髓20例（烤瓷牙需要拔髓者），患者年龄18～50岁,所有患者2个月内无服用免疫抑制剂及抗菌药物史,均未做过牙髓。? 
　　标本处理：标本用10%中性福尔马林浸泡，常规脱水，石蜡包埋，制备4～5μm厚切片，分别作HE染色和免疫组化染色。HE染色结果作为病分组标准，进一步区分各组标本。? 
　　主要试剂、仪器：MCP-1单克隆抗体（TBD公司），SABC显色试剂盒（武汉博士德公司），S-P超敏试剂盒（迈新生物）。? 
　　免疫组化染色步骤：石蜡切片常规脱蜡水化，PBS冲洗3分钟×3次，高温加热修复抗原（加热至95℃关火，室温放置冷却，蒸馏水冲洗3次，PBS浸泡5分钟）；PBS冲洗3分钟×3次；滴加过氧化酶阻断溶液（试剂A）室温下孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3分钟×3次；滴加正常非免疫动物血清（试剂B），室温下孵育10分钟；除去血清，滴加第一抗体（稀释浓度1∶[KG-*2]50），4℃过夜。PBS冲洗3分钟×3次；滴加生物素标记的第二抗体（试剂C），室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟×3次；滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液（试剂D），室温孵育10分钟，PBS冲洗3分钟×3次；DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。阴性对照采用PBS代替一抗,其余步骤相同。? 
　　 
　　结果? 
　　 
　　免疫染色结果显示，在健康牙髓组织中未见明显的MCP-1表达阳性细胞，在急慢性牙髓组织中MCP-1有不同程度的阳性表达，阳性染色细胞数量不均，阳性染色程度不一致，阳性表达为分布于细胞浆呈棕黄色的颗粒状物。表达MCP-1的细胞主要是单核/巨噬细胞和血管内皮细胞,中性粒细胞，成纤维细胞。在慢性炎症牙髓组织中还可观察到新生的毛细血管上有MCP-1表达阳性细胞。急、慢性组阳性表达无统计学差异。? 
　　 
　　讨论? 
　　 
　　MCP-1在炎症性疾病中的作用：大量的炎性疾病中都发现了MCP-1的存在,与单核/巨噬细胞免疫作用有关的疾病大多有MCP-1的参与。? 
　　首先，MCP-1对单核/巨噬细胞具有激活和趋化的双重作用。实验证明MCP-1促使嗜碱性粒细胞释放组胺的速度相当快，能在1小时内达到最高水平。MCP-1在炎症反应时与单核/巨噬细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞的激活有关联，在免疫应答中起重要作用，具有促炎的作用。
　　其次，由于MCP-1的缺失可以导致IL-4、IL-5、IL-10分泌受抑制，从而导致Th2型免疫反应受抑制，MCP-1在Th2型细胞因子的定位方面具有重要作用，促进巨噬细胞选择性激活途径的抗炎过程，是Th2型免疫应答必不可少的重要因素［1］。而正是Th1细胞向Th2细胞的不断转化导致巨噬细胞选择性激活，抑制经典激活的巨噬细胞的抗原提呈作用和促炎因子的分泌，并通过分泌血管生成因子和成纤维因子促进组织的愈合，从而避免炎症反应过度对组织造成的损害。这证明MCP-1还有抗炎的作用。? 
　　MCP-1在炎症牙髓中表达的意义：在本实验中观察到，急、慢性牙髓炎症组织中存在MCP-1阳性表达，正常牙髓组织中没有表达，这证明MCP-1作为一种诱导性表达趋化因子，在牙髓炎中存在的内毒素、细菌释放的各种酶、代谢产物、炎症介质及其他损伤因子的刺激和诱导下上调表达，参与了牙髓炎症反应。由于 MCP-1对单核/巨噬细胞的强烈趋化作用，MCP-1在炎症牙髓中的表达为炎症区单核/巨噬细胞的存在提供了机制性解释，同时趋化的单核/巨噬细胞再度表达MCP-1能够再趋化和激活更多的单核/巨噬细胞到炎症部位，在炎症反应中起到一种级联放大的作用。实验中观察到，慢性牙髓炎组织中MCP-1的表达比急性组略有增高，同时慢性组的单核/巨噬细胞数量也比急性组高，这说明MCP-1是单核/巨噬细胞持续趋化的主要动力。?  　　在慢性炎症组织中观察到，除一些炎症细胞表达MCP-1外，血管内皮细胞和成纤维细胞也表达MCP-1，并且在新生的毛细血管上有MCP-1阳性表达，这说明MCP-1参与了慢性炎症的恢复过程。MCP-1在血管内皮细胞中的表达，提示MCP-1有助于单核细胞穿越血管内皮细胞，到达炎症部位。MCP-1可以调节单核细胞表面特异性黏附分子CD11c、CD11b的表达，激活血管内皮细胞黏附分子的表达，导致单核细胞与内皮细胞紧密接触，最终穿透血管壁进入组织到炎症部位。? 
　　在部分炎症组织中，我们观察到中性粒细胞有阳性表达，这与以往报道不同。Johnston B［2］等在观察小鼠慢性脉管炎模型时也发现，在由MCP-1引起的募集的白细胞中，不是单核细胞而是中性粒细胞占大多数。流式细胞分析显示，CC趋化因子受体CCR1、CCR2在小鼠慢性诱导脉管炎炎症部位聚集的中性粒细胞上有异常表达。Raffaella［3］等也有类似的发现。这些实验都从不同的角度提示，在炎症的具体条件下，趋化因子受体的表达可能发生调整，而趋化因子（包括MCP-1）主要通过与相应的受体高亲和结合发挥生物学功效。因此对趋化因子受体的进一步研究将有助于进一步解释炎症条件下各趋化因子的“行为”，也可以为临床提供新的思路。? 
　　目前，在各种炎性疾病的治疗领域针对MCP-1的治疗方法越来越多，其中肌肉注射含有MCP-1拮抗剂7ND基因的质粒抑制动脉粥样斑块的形成，正处于临床应用阶段，试验证明是安全的，有望成为比药物治疗更有效的治疗方法。可以预见，通过对给药方式、给药途径的改进，针对MCP-1的治疗将为恢复牙髓炎症提供新的途径。? 
　　 
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　　1 WimNo?l Infection Stage-Dependent Modulation of Macrophage Activation in Trypanosoma congolense-Resistant and -Susceptible MiceInfect Immun，2002，70(11)：6180-6187.? 
　　2 Brent Johnston.Chronic inflammation upregulates chemokine receptors and induces neutrophil migration to monocyte chemoattractant protein-1.J Clin Invest，1999，103(9)：1269-1276.? 
　　3 Raffaella Bonecchi Up-Regulation of CCR1 and CCR3 and Induction of Chemotaxis to CC Chemokines by IFN-γin Human Neutrophils.The Journal of Immunology,1999,162:474-479.?