前体脂质体型猪肺表面活性物质对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的治疗作用

【摘要】  目的：观察前体脂质体型猪肺表面活性物质（PPPS）对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的作用。方法：将PPPS水化后，经气管滴入治疗整肺灌洗型成年兔呼吸窘迫模型，观察兔的生命体征、血气、动态肺顺应性等指标的变化。结果：整肺灌洗后模型兔的血气pH、PaO2急剧下降，PaCO2 轻度上升，心率明显减慢而呼吸频率增加，SBP和DBP均明显下降；支气管肺泡灌洗液中PS含量明显下降；病理检查提示出现肺出血、肺不张、肺泡萎缩、透明膜形成等病变，符合Ⅰ型重症呼吸衰竭临床诊断标准。经气管滴入PPPS后，可以使RDS模型兔的各项指标（pH、PaO2、PaCO2、HR、BR、SBP、DBP）明显改善，肺部的病理改变也明显减轻。统计学分析结果提示，治疗组和对照组pH（F=4.572，P=0.046）、PaO2 (F=557.586，P=0.000)、PaCO2（F=96.798，P=0.000）、TV（F=117.851，P=0.000）、Cydn（F=276.996，P=0.000）、HR（F=34.975，P=0.000）、BR（F=28.167，P=0.000）、SBP（F=124.751，P=0.000）和DBP（F=108.672，P=0.000）比较差异均有统计学意义；在治疗组中，各个时间点的 pH、PaO2 、PaCO2、TV、Cydn、HR、BR、SBP和DBP比较差异均有统计学意义。结论：PPPS对实验性PS缺乏和肺损伤造成的呼吸窘迫有显著的治疗作用。

【关键词】  肺表面活性物质；前体脂质体；呼吸窘迫综合症

    ［Abstract］Objective:To observe adult rabbits with acute respiratory distress syndrome (ARDS) treated by the proliposomes of pig pulmonary surfactant (PPPS). Methods:PPPS was instilled intratracheally. The control group was given saline only.Results:The following phenomena were observed:the Ph, PaO2 of the model rabbits descended sharply, the PaCO2 increased lightly, the HR slowed down obviously, but the BR increased, the SBP and DBP of the model rabbits descended markedly, and the PS content decreased dramatically. The pneumonic pathology changes showed pneumorrhagia, atelectasis, shrink of alveolus and pulmonary hyaline membrane. The above results indicated that it accorded with the standard of I-type of acute respiratory distress syndrome (ARDS). After the PPPS was applied to the model rabbits, each index nearly reached the normal level, and pneumonic pathology changes were also alleviated distinctly. The analytic result of statistics indicated that there was statistical significance in pH (F=4.572, P=0.046), PaO2 (F=557.586, P=0.000), PaCO2 (F=96.798, P=0.000), TV (F=117.851, P=0.000), Cydn (F=276.996, P=0.000), HR (F=34.975, P=0.000), BR (F=28.167, P=0.000), SBP (F=124.751, P=0.000), DBP (F=108.672, P=0.000) between the control group and the treated group. This shows PPPS has a great treatment effect on the model of the respiratory disdress syndrome in vivo lung-lavaged rabbits.Conclusions:PPPS has a great curative effect on the model of the respiratory distress syndrome in vivo lung-lavaged rabbits.

    ［Key words］Pulmonary surfactant; Proliposomes; Respiratory distress syndrome

    肺表面活性物质（Pulmonary surfactant，PS）的缺乏可引起呼吸窘迫综合征，特别是早产儿的发病率和死亡率都很高。外源性肺表面活性物质的替代治疗已被证实是呼吸窘迫综合征最有效的治疗手段［1］，在其它肺部疾病的治疗中也具有潜在的应用价值［2］。本研究目的是了解实验室制备的前体脂质体型猪肺表面活性物质［3］ 对整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的治疗作用。

    1  材料和方法

    1.1  前体脂质体型猪肺表面活性物质（PPPS）制剂

    为实验室自制，从新鲜猪肺中提取粗品肺表面活性物质，通过SFE-CO2的提纯后，用旋转蒸发仪将其制成颗粒状的前体脂质体，其化学成分、物理性质和体外活性方面已达到PS制剂的要求［4，5］。使用时加注射用水振荡混匀，使之形成等张的脂质体溶液。

    1.2  整肺灌洗兔呼吸窘迫模型的建立［6］

    正常成年纯种日本大耳白兔20只，雌雄各半，体重（2.65±0.31）kg。固定四肢和头部。普鲁卡因局部麻醉左腹股沟部，分离暴露股动脉，右腹股沟部去毛，用新生儿血压袖带固定，针样监护电极插入胸前区规定位置皮下，接BSM-830IK life scope 9型多功能生理监护仪。经耳缘静脉点滴3 ∶2 ∶1（葡萄糖 ∶生理盐水 ∶1.4%碳酸氢钠）液，输液泵控制输液速度（20 mL/h）。经喉镜气管插管，固定气管内导管，接Christina 型呼吸机，设定通气方式为CPAP，压力为0.4 kPa，FiO2在灌洗前为21％，以后为60％。按25 mL/kg体重从气管导管注入肺内37 ℃生理盐水，保持30～40 s后抽出，每隔5 min 1次，每只兔重复5次。每次灌洗前后用纯氧，以间歇正压通气方式，通气频率为40次/min，呼吸时间比为0.7 ∶1.3，吸气峰压为3.0 kPa，通气30 s，再改为实验设定呼吸方式和参数。第一次灌洗后肌肉注射呋塞米2 mg/kg体重。

    1.3  治疗方法

    1.3.1  分组  将灌洗兔随机分为两组，每组10只，各组间兔的体重和性别差异无统计学意义。治疗组第5次灌洗后给予PPPS剂量为100 mg（5 mL）/kg，对照组给相同体积的含5 mmol/L氯化钙的生理盐水。

    1.3.2  给药方法  用药前先加注射用水将PPPS水化成等张的脂质体溶液，分别稀释成含PS 20 mg/mL，于灌洗结束5 min后，经气管缓慢滴入肺内，均匀变动兔体位使之分布均匀。

    1.4  观察指标

    灌洗前、灌洗后、给药后15 min、2 h分别记录各项指标。

    1.4.1  取第1次和第5次灌洗液各1管，低速离心去除细胞杂物后，以氯仿-甲醇（2 ∶1）萃取，定磷法自动分光光度计（BECKMAN DU-65型）测定灌洗液总磷脂含量。

    1.4.2  各时点分别采取动脉血1 mL，密封置-4 ℃冰箱中保存。用NOVA7型自动生化分析仪进行血气分析测定。

    1.4.3  潮气量（tidal volume,TV）和动态肺顺应性（dynamic compliance,Cdyn）由呼吸机屏幕读出。Cdyn为VT除以吸气峰压与呼气末正压差值所得的商。

    1.4.4  生命体征、心率（HR）、呼吸频率（BR）、收缩压（SBP）和舒张压（DBP）均由监护仪读出。  

    1.4.5  给药后4 h，静脉注射20％乌拉坦致兔死亡后，立即剖胸取肺称重，作病观察。   

    1.5  统计分析

    采用SPSS11.0统计软件进行重复测量数据的方差分析，以0.05作为显著性差异的指标。

    2  结果

    2.1  灌洗液磷脂含量

    第1次和第5次灌洗液磷脂含量组为（171.23±16.93）μg/mL和（16.71±1.62）μg/mL；对照组为（173.96±18.09）μg/mL和（17.89±2.29）μg/mL。统计学显示，同组两次含量差异均有统计学意义（P<0.01），同次两组间含量差异无统计学意义（P>0.05）。

    2.2  肺灌洗兔血气指标变化

    结果见表1。灌洗后两组pH、PaO2均下降明显，PaCO2 上升，达到Ⅰ型重症呼吸衰竭临床诊断标准。开始治疗后，治疗组pH、PaO2均呈上升趋势，PaCO2呈下降趋势；给药后，治疗组自第15 min起开始恢复，第120 min，pH、PaO2和PaCO2均基本恢复好转。统计学显示，两组pH（F=4.572，P=0.046）、PaO2（F=557.586，P=0.000)、PaCO2（F=96.798，P=0.000）比较差异均有统计学意义；在治疗组中，治疗后15 min、120 min时pH、PaO2、PaCO2与灌洗后比较差异均有统计学意义。表1  实验期间肺灌洗兔血气变化（略）

    2.3  肺灌洗兔肺功能指标变化

    结果见表2。灌洗后两组兔肺潮气量、动态肺顺应性均明显下降。给药后，治疗组自第15 min起开始恢复，第120 min兔肺潮气量、动态肺顺应性均恢复好转。统计学显示，两组TV（F=117.851，P=0.000）、Cydn（F=276.996，P=0.000）比较差异均有统计学意义；在治疗组中，治疗后30 min、120 min时TV、Cydn与灌洗后比较差异均有统计学意义。表2  实验期间肺灌洗兔肺功能变化（略）

    2.4  肺灌洗兔呼吸频率和心率变化

    结果见表3。灌洗后两组心率明显减慢而呼吸频率均明显增加，生命体征严重异常，符合RDS模型要求。治疗组给药后至第15 min，心率缓慢增加，但随后又缓慢下降；对照组灌洗后心率逐渐减慢。治疗组给药后呼吸频率逐渐减慢；对照组呼吸频率继续增加至治疗后15 min时间点后开始缓慢下降。统计学显示，两组间HR（F=34.975，P=0.000）、BR（F=28.167，P=0.000）比较差异均有统计学意义（P<0.01）；在治疗组中，治疗后15 min、120 min时HR、BR与灌洗后比较差异均有统计学意义（P<0.01）。

    2.5  肺灌洗兔收缩压和舒张压的变化

    结果见表4。灌洗后两组的收缩压和舒张压均明显下降。给药后，治疗组SBP和DBP均缓慢上升；对照组SBP和DBP均缓慢下降。统计学显示，SBP（F=124.751，P=0.000）和DBP（F=108.672，P=0.000），SBP和DBP的数值变化在治疗组和对照组之间差异均有统计学意义；在治疗组中，治疗后15 min、120 min时SBP和DBP的数值与灌洗后的数值比较差异均有统计学意义。表3  实验期间肺灌洗兔呼吸与心率变化（略） 表4  实验期间肺灌洗兔血压变化（略）

    2.6  两组肺湿重比较

    对照组（17.12±3.37）g/kg体重，治疗组（9.04±0.35）g/kg体重，两组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。

    2.7  病理检查

    H-E染色结果见图1、图2、图3。对照组可见肺出血、肺不张、肺泡萎缩、肺透明膜形成，而治疗组肺改变相对较轻。

    图1  正常兔肺组织HE染色（×40）     图2  对照组兔肺组织HE染色（×40）     图3  治疗组兔肺组织HE染色（×40）

    3  讨论

    国外研究表明［7］，用整肺灌洗法建立ARDS模型较适合ARDS的PS改变后PS的替代治疗的研究。

    实验过程中，第1次和第5次灌洗液磷脂含量结果，在治疗组和对照组之间、同组两次含量比较差异均有统计学意义（P＜0.01），同次两组间含量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示灌洗造成肺PS急剧减少程度在两组间相近。

    由肺灌洗兔的血气指标变化、肺功能指标变化、呼吸频率和心率变化、收缩压和舒张压的变化、病理检查等结果可见：灌洗后两组的pH、PaO2均下降明显，PaCO2 上升，达到Ⅰ型重症呼吸衰竭临床诊断标准；兔肺潮气量、动态肺顺应性均明显下降，呼吸功能极度损害；灌洗后两组的心率明显减慢而呼吸频率均明显增加，生命体征严重异常；灌洗后两组的收缩压和舒张压均明显下降。给药后，治疗组SBP和DBP均缓慢上升；对照组SBP和DBP均缓慢下降。统计学显示，两组pH（F=4.572，P=0.046）、PaO2 (F=557.586，P=0.000)、PaCO2（F=96.798，P=0.000）、TV（F=117.851，P=0.000）、Cydn（F=276.996，P=0.000）、HR（F=34.975，P=0.000）、BR（F=28.167，P=0.000）、SBP（F=124.751，P=0.000）和DBP（F=108.672，P=0.000）比较差异均有统计学意义；在治疗组中，各个时间点的 pH、PaO2 、PaCO2、TV、Cydn、HR、BR、SBP和DBP比较差异也均有统计学意义。病理检查对照组可见肺出血、肺不张、肺泡萎缩、透明膜形成，而治疗组肺改变相对较轻。因此，本实验用兔成功制备了ARDS模型；PPPS对此模型有显著的治疗作用。

    本实验所制模型已形成严重呼吸窘迫，其灌洗液磷脂成分的减少和病理检查表明其发病机制可能是PS系统急剧严重受损和肺损伤。

【】
  ［1］ 陈 超.肺表面活性物质在新生儿肺部疾病中的应用［J］.实用儿科杂志,2003,18(11):652.

［2］ 李正红.肺表面活性物质的研究进展［J］.新生儿科杂志,2003,18(1):42- 44.

［3］ 武 荣,封志纯,杜 江,等.前体脂质体型猪肺表面活性物质的制备和研究［J］.广东医学,2005,26(3):320-321.

［4］ 武 荣,张守尧,封志纯,等.前体脂质体型猪肺表面活性物质的化学分析［J］.山东医药,2005,45(13):21-22.

［5］ 武 荣,封志纯,王 斌,等.前体脂质体型猪肺表面活性物质的物理化学性质的研究［J］.中国医学杂志,2007,17(11):1309-1311.

［6］ 封志纯,彭宜君.兔肺灌洗型呼吸窘迫综合症模型和猪肺表面活性物质的治疗作用［J］.中国病理生理,1996,12(2):159-160.

［7］ Lewis JF,Jobe AH.Surfactant and the adult respiratory distress syndrome ［J］.Am Rev Respir Dis,1993,147(2):218.