儿茶素对5/6肾切除大鼠肾脏微血管的保护作用及其机制
作者：曹艳, 何小解, 向伟, 易著文
【摘要】 目的：探讨儿茶素对5/6肾切除大鼠血管紧张素转化酶（angiotensin?converting enzyme, ACE）、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ）及肾脏组织微血管密度（microvessel density, MVD）的影响。方法：60只SD大鼠被分为假手术组、模型组和儿茶素组。模型组和儿茶素组大鼠切除5/6肾脏制作模型，假手术组不做肾切除。儿茶素8周与12周后，应用免疫组织化学法检测CD34标记的肾局部微血管数并密度；紫外分光光度法检测血浆与肾皮质中ACE活性；放射免疫法测定血浆与肾皮质中Ang Ⅱ浓度；苏木精和伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色及过碘酸?希夫（periodic acid?Schiff, PAS）染色后，半定量积分法评价肾小球硬化指数(glomerular sclerosis index, GSI)与肾小管间质损伤指数(tubule interstitial score, TIS)。结果：儿茶素组GSI与TIS在第8、12周末均显著低于模型组（P<0.05，P<0.01）；模型组和儿茶素组肾小球及小管周围MVD在第8周与第12周末较假手术组均明显降低（P<0.01）；儿茶素组血浆、肾皮质中ACE活性与Ang Ⅱ浓度在实验第8与第12周末均显著低于模型组（P<0.01）；Pearson相关分析发现，MVD与GSI、TIS、ACE、Ang Ⅱ呈负相关（P<0.01），ACE、Ang Ⅱ与GSI、TIS呈正相关（P<0.01）。 结论：儿茶素可有效阻止5/6肾切除大鼠肾脏微血管密度的减少，抑制肾小球硬化与肾间质纤维化的进展，这可能与儿茶素抑制ACE的活性，减少Ang Ⅱ的生成有关。
【关键词】 儿茶素; 微血管密度; 血管紧张素Ⅱ; 血管紧张素转化酶; 大鼠
Objective: To investigate the effects of catechin on angiotensin?converting enzyme (ACE) activity, angiotensin Ⅱ(Ang Ⅱ) content and microvessel density (MVD) in renal tissues of 5/6 nephrectomized rats.
Methods: Sixty SD rats were divided into 3 groups: sham?operated group, untreated group and catechin group. Animal model was reproduced by 5/6 nephrectomy. After 8? and 12?week administration, rats were sacrificed. Renal MVD was measured by immunohistochemical method with CD34 marking. Activities of ACE in plasma and renal cortices were measured by ultraviolet spectrophotometer, and Ang Ⅱ contents in plasma and renal cortices were measured by radioimmunoassay. Glomerular sclerosis index (GSI) and tubule interstitial score (TIS) were calculated by semiquantitative integration with hematoxylin and eosin staining and periodic acid?Schiff staining.
Results: After 8? and 12?week administration, the GSI and TIS in the catechin group were much less than those in the untreated group (P<0.05, P<0.01). MVDs around glomerulus and tubule at the end of the 8th and 12th week in the untreated group and the catechin group were much less than those in the sham?operated group (P<0.01). The ACE activities and Ang Ⅱcontents in plasma and renal cortices in the catechin group were much less than those in the untreated group (P<0.01). By Pearson correlation analysis, we found that MVD had negative correlation with GSI, TIS, Ang Ⅱ content, and ACE activity(P<0.01), however, the ACE activity and Ang Ⅱ content had positive correlation with GSI, TIS (P<0.01).
Conclusion: Catechin can prevent the 5/6 nephrectomized rats from decreasing of MVD and inhibit the progress of glomerular sclerosis and interstitial fibrosis by inhibiting the activity of ACE and reducing the production of Ang Ⅱ.
Keywords: catechin; microvessel density; angiotensin Ⅱ; angiotensin?converting enzyme; rats
肾脏微血管不仅是炎症、代谢等损害因素的承受者，也是肾脏损伤的直接参与者,维持肾脏微血管功能与数目对于预防肾脏病变持续性进展有重要意义［1, 2］。肾脏微血管包括肾小球毛细血管（glomerular capillary, GC）和肾小管周围毛细血管（peritubular capillary,PTC），除维持肾脏的正常结构和功能外，在慢性肾脏疾病进展中，肾脏微血管的减少程度与肾小球硬化和肾间质纤维化程度呈正比，微血管进行性减少是引起肾功能恶化的一个重要因素［3］。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ）是激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶的最主要刺激因子。还原型NADPH氧化酶的激活是活性氧自由基的主要来源，这些活性氧可以引起血管内皮功能障碍，细胞增殖，血管壁中膜肥厚、纤维化及出现炎症，也可通过肾素?血管紧张素系统（renin?angiotensin system, RAS）及Ang Ⅱ的Ⅰ型受体（angiotensin Ⅱ receptor Ⅰ, AT1)，抑制细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的降解，参与肾小球硬化和间质纤维化的发生与［4］。儿茶素是一种强效的非酶抗氧化剂，我们前期研究发现，儿茶素可通过改善血液流变学而降低尿蛋白的排泄与肾脏病理损伤程度［5］。Yang等［6］发现儿茶素在体外抑制血管紧张素转化酶（angiotensin?converting enzyme, ACE）活性。但儿茶素能否通过降低Ang Ⅱ的生成，降低肾脏微血管的丢失，延缓肾病理慢性进展，目前尚未见报道。本研究拟利用5/6肾切除大鼠模型，探讨儿茶素对5/6肾切除模型大鼠ACE、Ang Ⅱ及肾局部微血管密度（microvessel density, MVD）的影响及可能机制，为临床肾脏病防治提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要药品与试剂 儿茶素（购自湖南金农生物科技有限公司），ACE活性测定试剂盒（购自海军总），Ang Ⅱ放射免疫测定试剂盒（购自原子能研究所），CD34单克隆抗体（购自Santa Cruz公司），免疫组织化学PowerVision二步法试剂盒（购自北京中杉生物工程有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 5/6肾切除模型制备及分组 60只清洁级雄性SD大鼠，体质量180～200 g，由中南大学湘雅二医院动物实验室提供，许可证号为SYXK(湘)2004?0013。模型制作参照方法［7］，40只大鼠作5/6肾切除，采用随机数字表法进行完全随机化分组，分为模型组（n=20）和儿茶素组（n=20）。假手术组（n=20）行10%水合氯醛麻醉（3 mL/kg），暴露并剥离肾包膜，不作肾切除。模型制备后3 d，儿茶素组大鼠予400 mg/(kg·d)儿茶素（50 g/L）灌胃［5］，1次/d；模型组与假手术组给等量生理盐水灌胃。大鼠根据分组分别灌胃8周或12周。在整个实验过程中，所有大鼠均被饲养在12 h明、12 h暗，室温为23～28 ℃，相对湿度50%～70%的环境中，食用全价颗粒饲料（由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供）。另取5只大鼠同时制备5/6肾切除模型作为鉴定与备用。在模型制备完成后第1周和第4周，各杀1只大鼠按文献方法［7］鉴定模型是否制备成功。整个实验过程中模型组和儿茶素组大鼠仅在行单肾2/3切除时各死亡1只，并立即以备用鼠进行了补充。实验大鼠分别于治疗8周后和12周后两个时间点处死大鼠，留取血液标本与肾组织备用。
1.2.2 肾脏病理检查 各组大鼠处死后，取左侧残余肾，10%中性甲醛固定24 h后石蜡包埋。切片2～3 μm，行苏木精和伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色及过碘酸?希夫（periodic acid?Schiff, PAS）染色，采用Raij等［8］半定量方法评估肾小球硬化程度，计算肾小球硬化指数（glomerular sclerosis index, GSI）。每张切片至少观察40个肾小球，根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为5个等级。0级：基本正常；1级：肾小球硬化面积1%～25%；2级：硬化面积26%～50%；3级：硬化面积51%～75%；4级：硬化面积达到76%～100%。计算公式为［(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)］/肾小球总数。式中N1代表1级损害肾小球个数，……N4为4级损害肾小球个数。采用Radford等［9］半定量方法评估肾小管间质损伤指数（tubule interstitial score, TIS）。按皮质区肾间质纤维化程度、炎性细胞浸润程度、肾小管扩张或萎缩程度分级。损伤程度分为6级。0级为正常；1级为病变范围<10%；2级为病变范围10%～24%；3级为病变范围25%～50%；4级为病变范围51%～75%；5级为病变范围>75%。计算公式为［(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4+5×N5)］/观察的皮质区视野数。式中N1为1级病变皮质区视野数，……N5为5级病变皮质区视野数。每张切片至少观察40个皮质区视野，计算TIS。
1.2.3 血浆ACE活性与Ang Ⅱ含量的测定 ACE是一种可以从底物马尿酸?组氨酰?亮氨酸（Hip?His?Leu简称HHL）的C末端专一水解二肽的酶，HHL被ACE从C末端水解去除一肽His?Leu后，生成马尿酸。ACE活性使用分光光度法测定的马尿酸生成量来计算，具体试剂盒说明书。Ang Ⅱ测定采用放射免疫测定法，计数仪为SN?682型，标准曲线由不同量Ang Ⅱ标准品用放射免疫药盒测定获得。
1.2.4 肾皮质中ACE活性与Ang Ⅱ含量的测定 迅速取出肾脏，去除周围结缔组织，称取质量后放入4 ℃组织提取液20 mL中迅速匀浆，匀浆在4 ℃ 5 000×g离心20 min，取上清直接测ACE活性。Ang Ⅱ需提纯后再进行检测，具体方法如下，将上述上清液过柱，固相提取氮气吹干，采用高压液相色谱法（high pressure liquid chromatography, HPLC）分离，干燥物用0.25 mL流动相液溶解，进入Gilson HPLC系统进行分离，乙腈和七氟丁酸比例为55∶45，分别由双泵泵入，流速为0.8 mL/min，柱温24～25 ℃。C18柱（DiamonsilTM，250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm），进样环500 μL，检测池紫外波长215 nm，进样200 μL，收集Ang Ⅱ峰，大约1.2 mL流出液可使Ang Ⅱ收集完全。为避免样品与标准品间污染，每次进样后均需用洗脱液将柱及进样环冲洗干净，再用流动相平衡后进下一个样品。收集的Ang Ⅱ流出液干燥后用放射免疫测定法（radioimmunoassay, RIA）检测Ang Ⅱ浓度。
1.2.5 肾脏MVD的测定 按免疫组织化学PowerVision二步法试剂盒提供方法测定CD34，胞膜阳性为MVD。一抗为兔抗大鼠CD34单克隆抗体，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。观察者对每个标本单盲法随机观察20个间质视野计数CD34阳性的毛细血管腔个数，得出肾小管周围毛细血管（peritubular capillary, PTC）密度［10］，单位为个/mm2；每个标本查看20个肾小球横切面，计数CD34阳性的毛细血管腔个数，并取平均值，得肾小球毛细血管密度［11］，即CD34阳性毛细血管腔个数/肾小球横切面，单位为个/mm2。
1.3 统计学方法 统计学处理采用SPSS 11.5统计软件包。计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。多组资料间和同组多个时点资料间比较时，方差齐者，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；方差不齐者，采用Tamhane分析。相关关系应用Pearson相关分析。检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 各组大鼠肾脏组织形态学 实验第8周末，肾组织HE染色和PAS显示，假手术组肾脏病理大致正常，模型组与儿茶素组大鼠残余肾组织表现为肾小球肥大，毛细血管襻扩张，伴系膜组织增生，出现不同程度局灶节段肾小球硬化，毛细血管襻塌陷及球囊粘连。实验第12周末，模型组大鼠出现明显肾间质纤维化与肾小球硬化(见图1)。儿茶素组GSI与TIS在第8周和第12周末均显著低于模型组（P<0.01，P<0.05）。无论是儿茶素组还是模型组，GSI与TIS在第8周均显著低于第12周（P<0.01，P<0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠肾脏MVD 第8周与第12周末，假手术组肾小球毛细血管均开放良好，肾小管周围毛细血管排列分布及形态均正常。模型组与儿茶素组则出现程度不一的肾小球毛细血管腔扩张，毛细血管塌陷、闭塞及硬化，肾小管周围毛细血管局灶性病变，毛细血管腔缩小和变形(见图2)。与假手术组相比，模型组与儿茶素组肾小球及小管周围MVD在第8周与第12周末均明显降低（P<0.01）；儿茶素组肾小球及小管MVD在第8周与第12周末均较模型组显著增高（P<0.01），模型组与儿茶素组第8周末肾小球及小管MVD均高于第12周末（P<0.01，P<0.05）。见表2。
2.3 各组大鼠血浆及肾皮质ACE活性和Ang Ⅱ浓度 实验第8周末，模型组和儿茶素组血浆及肾皮质中ACE活性和Ang Ⅱ浓度均显著高于模型组（P<0.01）；与模型组相比，儿茶素组血浆、肾皮质中ACE活性与Ang Ⅱ浓度均显著降低（P<0.01）。实验第12周末，模型组与儿茶素组血浆与肾皮质中ACE活性和Ang Ⅱ浓度均显著高于假手术组（P<0.01）；与模型组相比，儿茶素组血浆、肾皮质中ACE活性与Ang Ⅱ浓度均显著降低（P<0.01）。模型组与儿茶素组血浆ACE活性和Ang Ⅱ浓度第12周末均高于第8周末。见表3和表4。表1 实验第8周和第12周末各组大鼠肾脏病理变化表2 实验第8周和第12周末各组大鼠肾脏MVD变化表3 实验第8周和第12周末各组大鼠血浆ACE活性和AngⅡ浓度表4 实验第8周和第12周末各组大鼠肾皮质中ACE活性和Ang Ⅱ浓度
2.4 相关性分析 Pearson相关分析发现，MVD与GSI、TIS、ACE、Ang Ⅱ呈显著负相关（r值分别为－0.658、－0.594、－0.695、－0.673，P<0.01），ACE、Ang Ⅱ与GSI、TIS呈显著正相关（r值分别为0.758、0.691、0.725、0.706，P<0.01）。
3 讨 论
肾小球硬化和肾小管间质纤维化是肾脏病到终末期肾病（end?stage renal disease,ESRD）的共同病特征。近年来，肾脏微血管损伤在肾脏纤维化发生与发展中的作用引起了不少学者的重视。肾脏微血管包括肾小球毛细血管和PTC，肾小球毛细血管和PTC丢失的程度同肾小球硬化和间质纤维化的程度密切相关［12］。本研究显示，第8周末，5/6肾切除大鼠已出现轻度肾小球硬化与肾间质纤维化，MVD也较假手术组显著降低；第12周末，肾小球硬化与肾间质纤维化程度更为显著，MVD也显著减少。相关分析发现，MVD与GSI、TIS呈显著负相关，说明5/6肾切除大鼠残余肾组织存在肾小球硬化、肾间质纤维化及微血管密度的减少，且肾小球硬化、肾间质纤维化和微血管密度的减少存在相互关联，但孰因孰果有待进一步研究。
RAS激活促进肾脏疾病进展目前已得到公认。Ang Ⅱ作为RAS的最终产物，不仅是一种血管活性物质，更是一种促肾生长因子，可导致肾小球高滤过，促进肾小球系膜细胞增生，诱发氧化应激，影响细胞因子和生长因子的表达，同时促进炎症细胞的浸润，从而引起肾小球硬化与间质纤维化［13, 14］。本研究发现，5/6肾切除大鼠在第8周末时血浆与肾皮质中Ang Ⅱ浓度即开始显著增高，第12周末则较第8周末更高，并与GSI、TIS显著正相关，提示5/6肾切除大鼠残余肾存在RAS紊乱，Ang Ⅱ持续增高参与了肾小球硬化与间质纤维化的发生与发展。ACE是Ang Ⅰ转化为Ang Ⅱ的调节酶，抑制ACE的活性即可降低Ang Ⅱ的生成［15］。在本研究中，血浆与肾皮质ACE活性与Ang Ⅱ浓度变化是一致的，而ACE活性的增高可加速Ang Ⅱ生成，进而营造Ang Ⅱ对肾脏持续损伤的微环境。研究发现，MVD与ACE、Ang Ⅱ呈显著负相关，说明血浆与肾皮质中ACE活性升高与Ang Ⅱ生成增加，可导致5/6肾切除大鼠残余肾微血管的丢失。其原因是因为Ang Ⅱ可通过引起肾小球内高压力和高灌注直接损伤肾小球内皮细胞，并可直接诱导内皮细胞凋亡，从而导致肾脏微血管的丢失［16］。
儿茶素是茶叶药效成分中的主要活性成分，除有强大的抗氧化活性外，尚具有抗动脉粥样硬化、对抗血管内皮细胞损伤的作用［17］。本研究显示，在第8周末与第12周末，儿茶素组MVD均较模型组显著增高，GSI、TIS则显著降低，说明儿茶素可以减少5/6肾切除大鼠残余肾肾小球硬化与肾间质纤维化，通过降低微血管损伤与丢失和（或）促进微血管新生而阻抑MVD的减少。儿茶素组血浆与肾皮质中ACE、Ang Ⅱ在第8周末与第12周末均较模型组显著降低，说明儿茶素可通过抑制ACE的活性降低Ang Ⅱ的生成。
综上所述，5/6肾切除大鼠残余肾可出现进行性肾小球硬化与肾间质纤维化，RAS系统紊乱导致血浆与肾局部ACE活性增高与Ang Ⅱ的生成增加，进而损伤血管内皮细胞，使肾局部微血管损伤和（或）丢失而出现MVD的减少，从而促进肾小球硬化与肾间质纤维化的发生。儿茶素可有效阻抑微血管密度的减少，抑制肾小球硬化与肾间质纤维化的进展。
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