祛湿化瘀方对脂肪肝大鼠脂联素?游离脂肪酸代谢路径的影响

                        作者：李红山, 冯琴, 许丽莉 陈少东 李雪梅, 胡义扬

【摘要】  目的：探讨祛湿化瘀方防治脂肪肝的作用及其对脂联素（adiponectin, ADP）?游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）代谢路径的影响。方法：采用Wistar雄性大鼠，以四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）皮下注射复合高脂低蛋白饮食制备大鼠脂肪肝模型。在造模开始2周后，将40只造模大鼠随机分为模型组和高、中、低剂量祛湿化瘀方组，灌胃用药2周。检测肝组织甘油三酯（triglyceride, TG）、FFA含量；观察肝组织病理变化（苏木精和伊红染色、油红O染色）；酶联免疫吸附测定检测血清ADP和肝组织脂联素受体2（adiponectin receptor 2, AdipoR2）、丙二酰辅酶A（malonyl?coenzyme A, malonyl?CoA）、腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP?activated protein kinase, AMPK）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl?coenzyme A carboxylase, ACCase）、肉毒碱脂酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase?1, CPT?1）含量的变化。 结果：与正常组比较，模型组大鼠肝组织出现明显大泡样脂肪变性；肝组织TG、FFA、FAS、ACCase和malonyl?CoA含量显著升高，血清ADP及肝组织AdipoR2、AMPK和CPT?1含量明显降低。高、中、低剂量祛湿化瘀方均可使脂肪肝大鼠肝脏的病理改变显著减轻，肝组织TG、FFA含量降低；高剂量祛湿化瘀方可使模型大鼠肝组织FAS、ACCase和malony1?CoA含量显著降低；高、中剂量祛湿化瘀方均能明显升高血清ADP和肝组织AdipoR2、AMPK、CPT?1含量。结论：祛湿化瘀方可通过提高血清脂联素水平，改善低脂联素血症，影响ADP?FFA代谢路径大鼠脂肪肝。

【关键词】  脂肪肝; 游离脂肪酸; 脂联素; 腺苷酸活化蛋白激酶; 祛湿化瘀方; 大鼠

    Methods: Forty Wistar male rats were used to establish the NAFLD model by subcutaneous injection of carbon tetrachloride (CCl4) for 4 weeks (twice weekly) along with high?fat and low?protein diet for 2 weeks. After two?week administration, the rats were randomly divided into four groups: untreated group, high?dose QSHYD group, medium?dose QSHYD group and low?dose QSHYD group. Another six rats were used as normal control. After 2?week treatment, the following indexes were detected: (1) liver pathology; (2) contents of serum adiponectin (ADP) and liver triglyceride (TG); (3) concentrations of liver FFA, adiponectin receptor 2 (AdipoR2), malonyl?coenzyme A (malony1?CoA), AMP?activated protein kinase (AMPK), acetyl?CoA carboxylase (ACCase), fatty acid synthase (FAS) and carnitine palmitoyl transferase?1 (CPT?1).

    Results: Compared with the normal group, there were physiological changes associated with hepatic steatosis and inflammation in liver tissues in the untreated group as observed by oil red O staining and HE staining. The TG, FFA, malony1?CoA, FAS, and ACCase concentrations in liver tissues in the untreated group were elevated significantly. While the contents of ADP in serum and AdipoR2, CPT?1 and AMPK in liver tissues in the untreated group were decreased markedly. The pathological damages in each QSHYD?treated group were significantly less than those in the untreated group. The TG and FFA contents in liver tissues in each QSHYD?treated group were significantly decreased. The FAS, ACCase and malonyl?CoA concentrations in liver tissues of the high QSHYD?treated group were reduced markedly as compared with the untreated group. High? and medium?dose of QSHYD could significantly increase ADP content in serum and AMPK, CPT?1 and AdipoR2 contents in liver tissues.

    Conclusion: QSHYD can affect the ADP?FFA pathway by increasing the content of serum ADP, which may be one of its important mechanisms in preventing and treating NAFLD in rats.

    Keywords: fatty liver; free fatty acid; adiponectin; AMP?activated protein kinase; Qushi Huayu Decoction; rats

    既往研究发现，以茵陈、虎杖、田基黄、姜黄等组成的中药复方祛湿化瘀方（Qushi Huayu Decoction, QSHYD）有显著的防治实验性脂肪肝的作用，特别是对四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）复合高脂低蛋白饮食诱导的大鼠脂肪肝模型肝组织游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的抑制率达到40.2%［1, 2］。前期研究还进一步明确了该方降低FFA对减轻肝损伤的意义，即通过抑制FFA以阻断其下游“FFA?蛋白酶B?肿瘤坏死因子α”肝脂毒性通路［3, 4］。但该方降低FFA的机制尚未明了，为此，本研究拟围绕FFA相关代谢机制，试图从“脂联素（adiponectin, ADP）?FFA代谢”路径角度观察该方影响FFA代谢的主要环节，进一步阐明该方防治实验性脂肪肝的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  Wistar雄性大鼠46只，体质量150～180 g，清洁级，购自院上海实验动物中心，于上海中医药大学实验动物中心清洁级动物房饲养、造模与观察。动物合格证号为SCXK(沪)2003?0003。

    1.2  药物与试剂  祛湿化瘀方组成：茵陈（安徽）15 g、虎杖（江苏）12 g、田基黄（江西）12 g、姜黄（四川）9 g、生栀子（福建）9 g。采用其有效成分，由上海中医药大学科技中心合作提取。茵陈、虎杖、姜黄单味药醇提，栀子、田基黄单味水提醇沉，再合并5味药有效成分，制备成生药含量为0.93、0.62、0.31 g/mL的药液，冷藏备用。分析纯CCl4和化学纯橄榄油，均购自中国医药集团上海化学试剂公司；血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase, AST）和FFA检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；甘油三酯（triglyceride, TG）检测试剂盒，购自浙江东欧生物工程有限公司；大鼠血清ADP，肝组织脂联素受体2（adiponectin receptor 2, AdipoR2）、腺苷酸活化的蛋白激酶（AMP?activated protein kinase, AMPK）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（acetyl?CoA carboxylase, ACCase）、丙二酰辅酶A（malonyl?coenzyme A, malonyl?CoA）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1（carnitine palmitoyltransferase?1, CPT?1）酶联免疫吸附测定（enzyme?linked immunosorbent assay, ELISA）检测试剂盒，均购自美国ADL公司。

    1.3  模型制备  模型制备参照方法［1］。首次以100% CCl4溶液5 mL/kg体质量皮下注射，其后用40% CCl4橄榄油溶液3 mL/kg体质量大鼠背部皮下注射，2次/周，共4周。第1、2周给予高脂低蛋白饲料（79.5%玉米粉、20%猪油、0.5%胆固醇），第3、4周予纯玉米粉饲料，自由饮水。正常组常规饮食。

    1.4  动物分组和给药  Wistar雄性大鼠46只，随机分为正常组6只、造模组40只。自造模第3周起，将造模组大鼠随机分为模型组和低、中、高剂量QSHYD组，各用药组及模型组大鼠按10 mL/kg体质量灌胃给药或饮用水，持续2周，正常组无任何处理。造模过程中，中剂量组大鼠在第17天死亡1只，低剂量组大鼠在第17天和第26天各意外死亡1只。

    1.5  检测指标与方法  造模结束，用2%戊巴比妥钠（2 mL/kg体质量）腹腔注射麻醉，经下腔静脉采血，离心后吸取血清，－70 ℃低温保存。在每只大鼠同一肝叶和部位切取小块组织，置入10%甲醛缓冲液中固定；从同一肝叶和部位切取一块肝组织用以制备冰冻切片；其余肝组织分装于离心管中低温保存。

    1.5.1  肝组织TG含量测定  取200 mg湿肝，加入3 mL乙醇?丙酮（1︰1）制备匀浆。10 000 r/min分散20 s×2次，在有塞的试管中充分摇匀，放置过夜。然后3 000 r/min（离心半径9 cm）离心，4 ℃，20 min，取上清液分装于1.5 mL离心管中，取9 μL上清液用于TG含量测定。

    1.5.2  肝组织FFA含量测定  称取200 mg湿肝，加2 mL生理盐水，冰浴中匀浆（10 000 r/min, 20 s×2次），将匀浆液4 ℃离心（3 600 r/min，离心半径9 cm，20 min），取上清，即成10%肝组织匀浆液，用生化试剂盒检测。

    1.5.3  肝组织苏木精和伊红染色  10％中性甲醛溶液固定的肝脏组织修整后于脱水机中脱水，后于自动石蜡包埋机中包埋，4 ℃保存，切片厚度为4 μm，进行常规苏木精和伊红（hematoxylin and eosin, HE）染色。病理分级依据非酒精性脂肪性肝病（non?alcoholic fatty liver disease, NAFLD）诊疗指南［5］，组织病诊断依据肝细胞脂肪变性占所获取肝组织标本量范围分为4度（F0～4）。F0：<5%肝细胞脂肪变；F1：5%～30%肝细胞脂肪变；F2：31%～50%肝细胞脂肪变；F3：51%～75%肝细胞脂肪变；F4：75%以上肝细胞脂肪变。同时依据炎症程度把非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）分为3级（G0～3）。G0：无炎症；G1：腺泡3带呈现少数气球样肝细胞，腺泡内散在个别点灶状坏死；G2：腺泡3带见明显气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死增多，门管区轻至中度炎症；G3：腺泡3带广泛出现气球样肝细胞，腺泡内点灶状坏死明显，门管区轻至中度炎症伴(或)门管区周围炎症。

    1.5.4  肝组织油红O染色  标本最佳切削温度（optimal cutting temperature, OCT）包埋剂包埋，液氮固定，冰冻切片，切片厚7 μm，采用修正异丙醇油红O染色法染色。

    1.5.5  血清ADP和肝组织AdipoR2、malony1?CoA、AMPK、FAS、ACCase、CPT?1含量测定  均采用ELISA法。各称取200 mg湿肝，加2 mL PBS缓冲液，冰浴中匀浆（10 000 r/min，20 s×2次），将匀浆液4 ℃离心（3 600 r/m，离心半径9 cm，20 min），取上清，即成10%的肝组织匀浆液。摸索该指标的最佳反应浓度后，严格按照ELISA试剂盒说明书规定的步骤进行检测。

    1.6  统计学方法  所有数据均采用SPSS 11.0软件包进行统计学分析，计量资料数据均以x±s形式表示，组间比较采用单因素方差分析LSD检验（最小显著差t检验），等级资料用Ridit分析。

    2  结  果

    2.1  各组大鼠肝组织TG和FFA含量  与正常组相比，模型组大鼠肝组织TG、FFA含量均显著升高（P=0.000）。各剂量QSHYD组的肝组织TG、FFA含量显著低于模型组（P<0.01）。各剂量组间肝组织TG、FFA含量比较，差异无统计学意义。见表1。表1  各组大鼠肝组织TG和FFA含量

    2.2  各组大鼠肝组织病理改变

    2.2.1  HE染色检测肝组织炎症与脂肪变性  模型组大鼠肝脏脂肪变性明显，肝细胞肿大变圆，胞浆疏松，内含大的脂肪滴；部分细胞可见细胞核挤向胞膜，呈以大泡性为主的脂肪变性，并可见广泛的气球样肝细胞及点灶状坏死，为典型的F4/G3表现。各剂量QSHYD组脂肪变性及炎症反应较模型组明显减轻，下降为F2～F3/G1～G2。见图1。Ridit分析结果显示，模型组脂肪变性程度较正常组显著升高；各剂量QSHYD组脂肪变性程度较模型组显著降低（P<0.05，P<0.01）；各剂量组间比较差异无统计学意义。见表2。

    2.2.2  油红O染色检测肝组织脂肪变性  与正常组比较，模型组脂肪肝大鼠肝细胞脂肪变性明显，脂滴大而多，小叶中央区染色较深，边缘区染色较淡。各剂量QSHYD组的上述变化显著减轻，其中以高剂量QSHYD组最为明显。见图2。图1  光学显微镜下观察各组大鼠肝组织病理改变（HE染色，×200）表2  HE染色观察各组大鼠肝组织脂肪变性

    2.3  各组大鼠血清ADP及肝组织AdipoR2含量  与正常对照组比较，模型组大鼠血清ADP及肝组织AdipoR2水平显著降低。高、中剂量QSHYD则能显著升高血清ADP含量；高、中、低剂量QSHYD均能提高肝组织AdipoR2含量。见表3。

    2.4  各组大鼠肝组织AMPK、ACCase和malonyl?CoA含量  与正常组比较，模型组大鼠肝组织AMPK含量显著降低（P=0.000），ACCase和Malony1?CoA含量显著升高（P=0.000）。高、中、低剂量QSHYD均能使AMPK含量升高（P<0.05，P<0.01），与正常组比较差异无统计学意义，且高剂量的效果优于低剂量（P=0.020）；高剂量QSHYD能使ACCase含量明显降低（P=0.000），中、低剂量QSHYD降低ACCase含量的作用不明显；高、中、低剂量QSHYD均能降低Malony1?CoA含量，且高剂量的作用效果明显优于低剂量（P=0.030）。见表4。表3  各组大鼠血清ADP及肝组织AdipoR2含量表4  各组大鼠肝组织AMPK、ACCase和malonyl?CoA含量

    2.5  各组大鼠肝组织FAS和CPT?1含量  较之正常组，模型组大鼠肝组织FAS含量显著升高，CPT?1含量则显著降低（P=0.000）。高、中剂量QSHYD均能使FAS含量明显降低，CPT?1含量明显升高，和模型组比较差异有统计学意义（P<0.05, P<0.01）。见表5。表5  各组大鼠肝组织FAS和CPT?1含量

    3  讨  论

    在NAFLD的发病过程中，FFA异常增多起着非常重要的作用，高FFA血症与高胰岛素血症一起形成NAFLD病理过程中的两个基本代谢缺陷，相伴的脂肪毒性和葡萄糖毒性造成肝损害，并诱致系统性代谢应激，产生代谢功能不全综合征［6］。

    NAFLD的发病中，导致肝脏FFA异常增多的原因包括胰岛素抵抗引起的脂肪组织脂解增多，肝脏合成FFA增多，FFA氧化分解减少以及极低密度脂蛋白合成与分泌障碍等［7］，其中肝脏对FFA合成与氧化代谢的失衡是FFA增高的重要原因之一。

    脂联素是由apM1基因编码的脂肪特异性细胞因子，又名脂肪细胞补体相关蛋白（Acrp30），具有促进糖脂代谢，减轻胰岛素抵抗，抗炎以及抗动脉粥样硬化等作用。有研究表明上述作用均依赖于脂联素介导的AMPK的激活，激活过程依赖于脂联素分子结构及其受体在靶细胞中的表达。脂联素在与其受体结合后，激活AMPK，引起其下游一系列分子的改变［8］，主要有以下几方面：（1）减少肝糖输出，其中AMPKα2亚单位是脂联素抑制肝糖输出最关键的靶点［9］；（2）使其下游限速酶ACCase失活而发挥促进脂肪酸氧化作用，降低血FFA水平［10］；（3）使ACCase磷酸化而活性降低，malonyl?CoA含量下降，从而减少肝脏脂肪沉积。另外，malonyl?CoA是CPT?1的抑制剂，它的减少也可以增加脂肪酸氧化，进一步减少肝脏脂肪含量［11, 12］。

    最近，You等［11］研究发现，ADP与主要表达于肝脏的AdipoR2结合后，能激活AMP激酶，使ACCase磷酸化而活性降低，malonyl?CoA含量下降，从而减少肝脏脂肪沉积。这样就形成了“ADP?FFA代谢”路径，这一路径在脂肪肝发病过程中起着非常重要的作用。

    本实验研究结果显示，祛湿化瘀方能显著降低脂肪肝模型大鼠肝组织TG、FFA、malony1?CoA、FAS、ACCase含量，升高血清ADP和肝组织AdipoR2、CPT?1含量。这一结果再次证实了祛湿化瘀方对实验性脂肪肝具有防治效果，并提示提高血清脂联素水平，改善低脂联素血症，进而影响“脂联素?游离脂肪酸代谢”路径，是其防治实验性脂肪肝的重要作用机制。但该方对“脂联素?游离脂肪酸代谢”路径上脂联素外的其他环节是否有直接干预作用，还有待于今后进一步研究。

【】
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