肝损伤的分子机制
作者：王虹蛟，孟威宏，王强，颜炜群
【关键词】 肝损伤
关于肝损伤机制及对其防治的研究，近年来已成为国内外生物学、医学研究的热点之一［1～3］。本文复习近年来有关肝损伤的分子机制国内外作如下综述。
1 TNF诱导的肝细胞损伤
TNF-α是一种主要由巨噬细胞产生的细胞因子。TNF-α对不同的细胞类型发挥各不相同的作用，在许多重要的病理和生理条件下作为一种重要的介质存在［4］。TNF-α还是凋亡的重要介质之一。TNF的生物学效应主要由TNF-R1 介导［5，6］。TNF-R1胞内区含死亡结构域，通过激活核转录因子NF-κB使某些细胞增殖、分化，也可触发信号传导级联而导致细胞凋亡。
TNF与TNF-R1结合，可通过如下3条途径触发细胞死亡：（1）一条途径（TNF+TNF-R1-TRADD-FADD）：TNF与TNF-R1结合并使TNF-R1胞内三聚化，后者与TRADD连接［7］。TRADD的C端含一个死亡结构域（195～305氨基酸残基），与和其连接的TNF-R1死亡结构域有高度同源性。TRADD的死亡结构域又可与FADD和TRAF2（TNF receptor-associated factor 2）连接，引起不同的生物学效应。（2）第2条途径（TNF+TNF-R1-TRADD-RIP）: TNF和TNF-R1结合，通过TRADD聚集RIP（Receptor-interacting protein）［8］。RIP是一个蛋白激酶分子，含671个氨基酸，分子量76000道尔顿。N端含一个激酶区，C端含一个死亡区。其死亡区优先与TRADD死亡区结合并与TNFR1发生较弱的连接。RIP除与RADD连接传导凋亡信号外，其1～300和300～558两个氨基酸残基区也能与TRAF2发生连接，激活NF-κB而产生抑制细胞凋亡的作用［9］。（3）第3条途径:以脂质神经酰胺（Ceramide,CM）作为第二信使的途径,TNF诱导细胞凋亡的另一条途径是鞘磷脂酶（sphingomyelinase,SMase），其产生的CM作为死亡信号级联中重要的信号物质，可引起细胞凋亡和NF-κB激活［10］，同时，神经酰胺可直接与线粒体内细胞色素C结合，释放出线粒体；它也可通过促进氧化应激而发挥作用。神经酰胺也可活化蛋白磷酸化酶，进而影响Bcl2家族成员的磷酸化过程。CM有调节蛋白磷酸化、激活蛋白激酶、影响c-myc原癌基因表达、激活NF-κB和PLA2，以及使前列腺素释放等作用。Gabriele［11］等研究老鼠实验性肝炎的细胞因子表达，发现TNF显示了具有诱导肝损害的能力，T细胞激活和细胞因子诱导是肝炎的重要因素，肝损伤后在血浆和肝组织中测到TNF、FN、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12。
TNF-α的肝损伤机制：（1）直接引发肝细胞凋亡：TNF-α可通过肝细胞表面的TNF-R激活caspases家族，触发凋亡的级联反应，诱导肝细胞凋亡；（2）与IL协同作用，诱导多形核白细胞在肝窦聚集，并诱导肝细胞、血窦内皮细胞表达粘附分子ICAM-1，加强白细胞和肝细胞及内皮细胞的粘附作用。TNF-α同时还激活白细胞，使之产生呼吸爆发，释放氧自由基和溶酶体酶，引起肝细胞和内皮细胞损伤；（3）白细胞在肝血窦内的聚集，可使肝窦变窄，血液受阻，同时白细胞激活后释放的酶又可激活补体和凝血系统，导致微血栓形成；（4）TNF-α可诱导内皮细胞产生内皮素ET-1，ET-1除可引起白细胞粘附和红细胞聚集外，还使血管收缩，导致组织器官缺血性损伤，并增加门脉高压；（5）TNF-α可诱导肝细胞和枯否细胞的一氧化氮（NO）合成增高，少量的NO具有舒张血管、传递信息和抑制血小板聚集的作用。但大量的NO则与氧自由基生成毒性较大的氮自由基，产生过氧化损伤；（6）TNF-α可激活磷脂酶A2（phospholipase A2,PLA2），后者是细胞膜磷脂代谢和产生脂类介质的关键酶。一方面使溶血卵磷脂合成增加，攻击肝细胞膜结构，导致肝细胞死亡。另一方面促进炎性介质LTs、TXs、PGs等合成增加，加重炎性损伤。
2 自由基致肝损伤的机制
自由基在体内的各种生理活动中起着重要的作用，但同时由于自由基的化学性质高度活泼性，可以损伤机体的生物大分子，从而导致细胞损伤。
2.1 自由基对肝细胞的直接损伤
2.1.1 对脂质的损伤 肝细胞的各种膜相结构都含有丰富的不饱和脂肪酸，极易受氧自由基的攻击，引起脂质过氧化（lipid peroxidation,LP）链式反应，形成一系列脂质过氧化物（LPO）。不饱和脂肪酸的过氧化一方面可以生成更多毒性更大的脂自由基，同时使膜的完整性破坏，导致膜受体、膜的离子通道、膜通透性均遭到破坏，使钙离子内流增加，同时线粒体膜钙泵受抑。细胞内钙离子的浓度增加可使细胞高度水肿，同时激活钙依赖的蛋白激酶、诱发黄嘌呤氧化酶生成，产生更多的氧自由基，形成恶性循环，最终导致细胞死亡。
2.1.2 对蛋白质的损伤 脂质过氧化产生的脂自由基可和氧自由基一起，对细胞内蛋白分子进行氧化反应，使蛋白质分子发生聚合、断裂、变性，使酶活性丧失，导致细胞死亡。
2.1.3 对DNA的损伤 引起DNA损伤的氧自由基主要为羟自由基（hydroxyl radical,OH· ） ，它对DNA链的脱氧核糖、碱基和磷酸二酯键骨架均可造成不同程度的损伤，引起突变、凋亡或坏死。此外，抑癌基因P53受OH·的攻击而失活，也促进癌变的发生。OH·对碱基的修饰也可引起DNA复制时的碱基错配，导致突变的发生。此外，氧自由基还可使DNA之间、DNA和蛋白质之间也发生交联，导致细胞死亡。
2.1.4 细胞内离子负荷增加 除Ca2+增加外，Fe2+和Cu2+也有增加。Fe2+和Cu2+的增加既是氧自由基产生的原因，又是氧自由基作用的结果。氧自由基可以从以下途径引起Fe2+的增加：氧自由基和LPO破坏红细胞，血红蛋白释放Fe2+；氧自由基可使铁蛋白释放Fe2+增加；胞浆中pH下降，Fe3+从转铁蛋白上解离加速；肝细胞本身破坏可释放Fe2+。Fe2+增加后，又可通过各种反应加速氧自由基和LPO的产生，形成恶性循环。
2.2 自由基对肝细胞外的影响
2.2.1 局部微循环障碍 氧自由基可诱导肝细胞及各种免疫细胞表达粘附分子，使多形核白细胞聚集，并产生花生四烯酸，使微循环内皮细胞损伤；并产生的白介素B4可对白细胞产生趋化作用； OH·可增加血小板的聚合。使微循环局部微血栓形成，造成微循环障碍，加重组织的缺血、缺氧，产生更多的自由基。
2.2.2 影响炎症反应 氧自由基本身及自由基的代谢产物均可通过激活补体、刺激免疫细胞产生细胞因子等手段而加重炎症反应的程度；自由基引起的肝细胞坏死也可使炎症反应加剧。另一方面，氧自由基又可使淋巴细胞膜通透性增加，ATP酶活性降低，导致Ts细胞功能降低，淋巴转换率下降，IL-2产生下降，NK活性降低。
2.2.3 激活贮脂细胞 贮脂细胞是肝细胞外基质的主要来源，静息状态含有大量脂滴，主要分泌Ⅲ型胶原蛋白，氧自由基可刺激贮脂细胞向成纤维细胞转化，由分泌Ⅲ型胶原转变为分泌Ⅰ型胶原，同时，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原总量增加，致使肝纤维化的发生。
2.2.4 肠源性内毒素血症 氧自由基、LPO及其降解产物可导致肝枯否细胞功能下降，清除内毒素的能力降低，同时微循环障碍导致内毒素存留时间延长，导致肠源型内毒素血症的发生。
2.3 活性氧自由基在肝细胞损伤中的作用 活性氧自由基（react ive oxygen metabolites,ROM）与许多类型的肝脏疾病的发病机制相关。如，药物诱导的肝脏损伤通常是由于活性代谢物的生成，这些代谢物可能通过直接或免疫机制导致坏死或凋亡。当肝细胞暴露于过量的ROM时将发生氧化应激，影响细胞的多种功能。它可通过活化转录因子（如NF-KB）而改变相关基因的表达［12］，使得细胞因子，化学因子，粘附分子，Fas-L，生存基因（survival genes）等表达量改变，而线粒体内产生的脂质过氧化物则能诱导线粒体PT开放，导致致命后果［13］。蛋白质的氧化（如C=O羰基的生成）以及DNA的氧化也是氧化应激的化学结果。除此之外，氧化应激还与一些退行性疾病相关（如衰老）。氧化应激造成的细胞死亡在ROM较低浓度下就可能发生，此时细胞主要发生凋亡，在凋亡过程中，氧化应激通常是线粒体中细胞色素C的耗竭，PT（解偶联作用）或GSH的大量耗竭等的继发反应［14］；而当细胞暴露于较高浓度的ROM时，则可能以坏死形式死亡，即所谓的“中子炸弹（neuron bomb）”作用。临床上氧化应激在肝脏疾病中的重要后果主要是改变了基因表达，继而触发炎症，肝纤维化或癌变，或启动或加强凋亡。IAP（hibitor of apoptosis proteins）家族成员可能抑制效应caspase如caspase 3和7［15］。NF-κB抗凋亡作用至少部分与其对IAPs的上调作用相关［16］。另外，caspase中起关键作用的巯基还可能受到NO［17］或ROM的攻击，从而使caspase丧失活性，继而抑制凋亡，但这种攻击可能同时导致坏死，尤其当自由基的浓度很高时更易引发坏死。除caspase类水解酶外，机体内的一些成分也可选择性作用于其他一些靶分子从而干扰细胞死亡的级联反应。
2.4 氮自由基对肝脏的损伤 NO对肝脏的作用表现为双重性，并与其本身活性氧的浓度有关。当NO及活性氧水平均较高时，二者可发生氧化反应，消除了NO的扩血管作用，同时生成细胞毒性物质过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite,ONOO-）。发挥自由基对肝细胞的DNA、蛋白质和脂质的毒性。而NO作为小分子亲脂性气体，极易弥散入细胞内，NO的肝细胞毒性主要表现在：（1）对线粒体呼吸的抑制：NO对线粒体的抑制作用呈浓度依赖性和酶的选择性，其中最敏感的酶是线粒体乌头酸酶，乌头酸酶存在于线粒体内膜上，极易与亲脂性的NO结合，导致线粒体内多种酶类的灭活，使线粒体呼吸抑制，导致细胞死亡。（2）对肝细胞DNA合成蛋白质、糖类代谢的抑制：NO可通过与DNA结合，使核酸亚硝酰化，破坏DNA双螺旋结构，抑制核糖核苷酸还原酶，或通过抑制DNA合成的酶类等手段，抑制DNA合成，致使DNA断裂和突变。NO抑制肝细胞合成蛋白质的作用机制尚不清楚，可能是作用于转录后水平。NO的这种作用可能是慢性肝病时血浆蛋白和凝血因子降低的原因之一。（3）NO对肝细胞的葡萄糖合成的影响：在诱导NO生成的研究中，除发现伴有蛋白质的合成降低外，葡萄糖的产量也有明显下降，这或许是肝病或脓毒血症时，血糖降低的原因之一。此外，NO的扩张血管作用与肝硬化时高动力循环的形成有关：血管内皮细胞产生的NO作用于血管平滑肌细胞中的鸟苷酸环化酶，使cGMP生成增多，使平滑肌细胞舒张，血管扩张。而周围血管扩张则是肝硬化门脉高压钠水潴留、腹水及肝肾综合征产生的始动因素。
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