糖耐康颗粒对胰岛素抵抗3T3–L1脂肪细胞炎症因子的影响

                              作者：牛洁 刘铜华 王志程 杨丽霞

【摘要】  目的：探讨糖耐康颗粒对胰岛素抵抗3T3–L1 脂肪细胞炎症因子的影响。方法：通过地塞米松与胰岛素共同诱导3T3–L1 脂肪细胞建立胰岛素抵抗模型，检测中药糖耐康对细胞上清中TNF–α、IL–6、CRP 水平的影响。结果：与正常组比较，模型组TNF–α、IL–6、CRP 水平明显升高；经中药糖耐康以及西药吡格列酮干预后，TNF–α、IL–6、CRP 水平显著下降，与模型组比较有显著差异。结论：TNF–α、IL–6、CRP 参与胰岛素抵抗的发生，中药糖耐康可能通过降低炎症因子的水平发挥改善胰岛素抵抗的作用。

【关键词】  糖耐康；3T3–L1 脂肪细胞；胰岛素抵抗；炎症

    〔Abstract〕 Objective To study the effect of Tangnaikang granule on inflammatory factor of insulin-resistant3T3-L1 adiopocytes. Methods After utilizing dexamethasone and insulin to establish insulin-resistant modle byinduced 3T3–L1 adipocyte, the levels of tumor necrosis-alpha(TNF–α),interleukin–6(IL–6) and C–reactive protein(CRP) of cell supernatant were detected. Results The levels of TNF–α, IL-6 and CRP of model group weresignificantly increased compared with those of normal group.After intervention of Tangnaikang and Pioglitazone, thelevels of TNF–α, IL–6 and CRP were obviously decreased compared with those of model group. Conclusion Theinflammatory factor of TNF–α, IL–6 and CRP participated the formation of insulin resistance,Tangnaikang coulddegrade the inflammatory factor levels to improve the insulin resistance.

    〔Key Words〕 Tangnaikang; 3T3–L1 adipocyte; Insulin Resistance; Inflammation

    胰岛素抵抗（Insulin Resistance, IR）是2 型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）发病中的主要环节，其形成机制复杂，近年来研究提示IR 是个慢性非特异性炎症过程，慢性炎症参与了IR 的发生与[1]。因此，干预炎症过程，改善IR 将成为防治T2DM 的新趋势。故本实验以炎症–IR 为切入点，通过观察中药复方糖耐康对胰岛素抵抗3T3–L1脂肪细胞中炎症因子水平的影响，为其防治IR 及T2DM 提供可靠依据。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    3T3–L1 前脂肪细胞株购自ATCC；DMEM 高糖培养基，新生牛血清均购自GIBCO 公司；牛胰岛素，3– 异丁基–1– 甲基黄嘌呤（IBMX），地塞米松（DEX），油红“O”染剂均购自Sigma 公司；葡萄糖检测试剂盒购自国药集团化学试剂北京有限公司；TNF–α 抗体试剂盒，IL–6 抗体试剂盒，CRP 抗体试剂盒均购自美国RB 公司。

    1.2 实验药品

    糖耐康颗粒（人参、夏枯草、女贞子、番石榴叶、三白草组成）：9 g/ 袋，由四川美大康佳乐药业有限公司生产提供；盐酸吡格列酮片（艾汀）：15 mg/ 片，购自北京太洋药业有限公司。

    1.3 主要仪器

    CO2 孵育箱：BB16/BB5060 型， 德国Heraeus公司；超净工作台：半导体设备一厂生产；台式高速冷冻离心机：ST–21 型，美国索福公司；高压蒸汽消毒器：HVE–50 型， 日本HIRAYAMA 公司；电热恒温培养箱：HHB11420 型，天津实验仪器厂生产；低速自动平衡微量离心机：LDZ4–0.8 型，北京医用离心机厂生产；倒置显微镜：日本Nikon 公司；酶标仪：Multiscan MK3 型；实验耗材：美国COSTAR 公司。

    1.4 方法

    1.4.1 3T3–L1 前脂肪细胞诱导分化[2] 将3T3–L1 前脂肪细胞置于含10% 新生牛血清的DMEM 高糖培养基中，37℃，5%CO2 饱和湿度下培养。细胞状态良好时接种于培养板，待细胞融合2 d 后，换用含10% 新生牛血清、0.5 mmol/L IBMX、10 μg/mL 胰岛素、0.25 μmol/L DEX 的DMEM 高糖培养基（即诱导溶液1）培养48 h，后换用含10% 新生牛血清、10 μg/mL 胰岛素（即诱导溶液2）再培养48 h，随后以10% 新生牛血清的DMEM 高糖培养基继续培养，2 d 换1 次培养液，诱导分化8~12 d 的3T3–L1前脂肪细胞90% 以上可分化为成熟的脂肪细胞，进行油红“O”染色鉴定为脂肪细胞后，方可用于实验。

    1.4.2 脂肪细胞鉴定 采用油红“O”染色法，具体过程如下：将诱导分化结束的脂肪细胞，先用PBS 洗3 次以除去培养基；中性甲醛固定10 min，然后水洗，将细胞晾干20 min；加入油红“O”染液染色30 min（密封）；再用60% 异丙醇冲洗，以除去多余的染料，然后水洗；加入苏木素复染细胞核2 min，用水冲洗；稍干后以甘油明胶封固；在倒置显微镜下观察。

    1.4.3 3T3–L1 胰岛素抵抗细胞模型的建立[3，4] 将成熟的3T3–L1 脂肪细胞用含DEX 1 μmol/L、Insulin10 nmol/L 及10% 新生牛血清的DMEM 培养基孵育96 h，后取培养液上清，采用葡萄糖氧化酶法，以培养基中的葡萄糖的消耗量反映胰岛素抵抗情况，建立胰岛素抵抗细胞模型。1.4.4 含药血清的制备 健康雄性Wistar 大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）60 只，体重230~250 g，适应性喂养2 d 后，随机分为空白组、中药糖耐康（TNK）组、西药吡格列酮（BG）组，根据人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值，换算不同药物灌胃剂量[5]，然后在等效剂量10倍基础上灌胃，空白组给予相同体积的生理盐水，TNK 组按8.1 g/kg 剂量灌胃（在等效剂量10 倍基础上），BG 组则按4.05 mg/kg 灌胃，连续给药5 次，每日相同时间分别给药2 次，在第4 次灌胃后禁食不禁水12 h 后给予最后1 次给药，1 h 后，10% 水合氯醛腹腔麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，常温静置2 h 后， 低温离心3 000 r/min×20 min，0.22μm 滤膜过滤除菌，用1.8 mL 冻存管分装（每支1.5mL），－ 20℃保存备用。

    1.4.5 分组方法及给药 分为7 组，分别为正常脂肪细胞组、胰岛素抵抗组、空白组、TNK 低剂量组、TNK 中剂量组、TNK 高剂量组以及BG 组。其中，空白组给予对应血清浓度为6.4%；TNK 低、中、高剂量组组给予对应血清浓度分别为2.56%、6.4% 及16%；西药BG 组给予血清浓度为6.4%。

    1.4.6 观察指标 ① 3T3–L1 前脂肪细胞及诱导分化后的形态学观察；② TNF–α、IL–6、CRP 的ELISA 检测：按照试剂盒说明书操作。

    1.5 统计方法

    采用SPSS 12.0 统计软件，计量资料用均数±标准差（ ）表示，计量资料两组间比较采用t 检验，多组比较，如方差齐时，可采用单因素方差分析，如方差不齐时，可采用非参数检验（秩变换分析方法），P ＜ 0.05 有统计学意义。

    2 结 果

    2.1 3T3–L1 前脂肪细胞及诱导分化后的形态学

    3T3–L1 前脂肪细胞呈梭形，胞浆中无脂滴，形态类似于成纤维细胞。诱导分化后，细胞逐渐变圆，胞浆中有脂滴，当分化到8~12 d 时，3T3–L1前脂肪细胞90% 以上可分化为成熟的脂肪细胞，表现为胞浆丰富，含有大量的脂滴，脂滴分布于核周围，形成“戒环样”结构，为典型的成熟脂肪细胞形态，经油红染色后观察到脂滴着红色，细胞核着蓝色。

    2.2 各组含药血清对胰岛素抵抗3T3–L1 细胞TNF–α、IL–6、CRP 水平的影响见表1，图1~3。表1 各组细胞上清中TNF–α、IL–6、CRP 水平从表1 及图1~3 可看出，与正常脂肪细胞相比，IR 细胞模型上清中TNF–α、IL–6、CRP 水平明显升高，统计学上有明显差异。与模型组比较，TNK 各剂量组以及BG 组均有不同程度改善，其中，TNKM 组、TNKH 组以及BG 组改善最为明显。TNKH 组可显著降低IR 细胞上清中TNF–α 的含量，与BG 组比较有统计学差异。TNKM 组可明显降低细胞上清中IL–6 的水平，与BG 组比较无统计学差异。与中药TNK 各剂量组比较，BG 组可明显降低细胞上清中CRP 的水平，统计学上有显著差异。

    3 讨 论

    越来越多的研究表明炎症因子在T2DM 及IR的发生中扮演着重要的角色，主要包括TNF–α、CRP、IL–6、抵抗素、瘦素等，这些炎症因子相互联系、相互作用，形成一个复杂的调控，启动炎症信号通路，从而干扰正常的胰岛素信号传导，最终导致IR 的发生。其中，TNF–α、CRP、IL–6 与IR 形成关系密切。有报道称，在肥胖与IR 的啮齿动物模型中，脂肪组织中的TNF–α 水平是升高的，存在有TNF–α 信号遗传缺陷的小鼠或通过抗TNF–α 免疫球蛋白来中和TNF–α 均可改善胰岛素敏感性[6，7]。在IR 的研究中，表明CRP 水平与体重指数、空腹胰岛素及胰岛素原呈正相关，与胰岛素敏感性呈负相关，说明CRP 参与IR 的发病过程[8]。在T2DM 肥胖组中，存在着严重的IR，IL–6 水平是显著升高的，IL–6 与胰岛素抵抗指数、体重指数成正相关，经后，患者中胰岛素抵抗指数、IL–6 水平明显改善，同样表明IL–6 参与了T2DM 胰岛素抵抗的发生[9]。本实验结果显示，IR 细胞模型上清中TNF–α、IL–6 及CRP的含量明显升高，证实三者参与IR 的发生，这与之前报道是一致的。中药复方糖耐康是以“清热生津、益气养阴”为组方原则，主要由人参、女贞子、夏枯草、番石榴叶、三白草5 味药组成，可明显降低血糖，改善IR，增加胰岛素敏感性[10，11]。研究也表明，人参皂甙可显著降低血糖以及胰岛素水平，并通过降低血清中CRP、MMP–9 水平而改善T2DM 及其并发症[12-14]。番石榴叶提取物有明显降低血糖及提高胰岛素敏感性的作用[15]。本实验结果显示，中药糖耐康可明显降低IR 细胞上清中TNF–α、IL–6及CRP 的含量。其中，中药糖耐康高剂量组在降低TNF–α 方面优于西药吡格列酮；中剂量组在降低IL–6 方面类似于西药吡格列酮。结合前期资料，推测中药糖耐康可通过降低炎症因子的水平来改善IR的作用。综上所述， 脂肪组织分泌的TNF–α、IL–6、CRP 炎症因子可降低胰岛素的敏感性，参与IR 的发生，中药糖耐康能降低炎症因子的水平从而改善IR。在3T3–L1 脂肪细胞中，这些炎症因子启动哪条炎症信号通路导致IR 的形成；中药糖耐康具有西药吡格列酮相似的作用，是否通过发挥激活PPARγ来改善IR，尚有待进一步深入研究。

【】
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