SLE 相关基因 IFIT1 免疫调节功能的初步研究
【摘要】 目的：研究系统性红斑狼疮（SLE）相关基因 IFIT1 的功能。方法：首先将 IFIT1 从穿梭表达克隆转入真核表达克隆，然后转导进入 Jurkat 细胞系，用有限稀释法筛选单克隆；再用 CD3 和 CD28 刺激单克隆，检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子分泌等免疫生物学指标；最后应用 RNAi 技术，下调 IFIT1 的表达，检测细胞因子分泌，比较分析 IFIT1 的功能。结果：IFIT1 的过度表达在 T 细胞中能诱导白细胞介素 IL-4 和 IL-10 的分泌增加，下调 IFIT1 的转录水平后能部分下调 IL-4 和 IL-10 表达，而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关。结论：SLE 相关新基因 IFIT1 在细胞因子的产生中起了重要作用，可能与 Thl/Th2 的失衡有关。
【关键词】 系统性红斑狼疮；IFIT1；细胞因子；基因干预
〔Abstract〕Objective To study the function of IFIT1, a novel gene associated with the systemic lupus erythematosus (SLE). MethodsFirst an expression clone of IFIT1 was generated by performing an LR recombination reaction between the entry clone from Genecopoiea and a GatewayTM destination vector. Then the vector was transfected into the Jurkat T cells. Single clone cells expressing EGFP and IFIT1-EGFP were selected by standard limiting dilution method. The stable transfectants of EGFP and IFIT1-EGFP were stimulated with anti-CD3 and anti-CD28. Cell surface antigen expression were detected by flow cytometry. The apoptosis and expansion of each transfectant were detected according to the manufacture's instruction. The culture supematants were assayed for cytokines by sandwich ELISA. Furthermore transfection of gene silence vector which could produce anti-IFIT1-specifics small RNA duplexes partially blocked the expression of overexpressed IFIT1 in Jurkat T cel1. The same assays were done by stimulation with anti-CD3 and anti-CD28. ResultsThere were no significant difference in the expression level of the various cell surface molecules, apoptosis and expansion among Jurkat, Jurkat/EGFP, and Jurkat/IFIT1-EGFP transfectants. But it was found that the Jurkat/IFIT1-EGFP could enhance the production of IL-4 and IL-10. After knocking down the expression of IFIT1 by RNAi, the levels of IL-4 and IL-10 production were partially decreased.ConclusionThe results indicate the SLE related-gene IFIT1 may play an important role in the production of cytokines and may interfere in the Th1/Th2 balance.
〔Key Words〕Systemic lupus erythematosus; IFIT1; Cytokines; Gene interfere
系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）是由遗传、性激素、感染、环境等因素相互作用所致的一种多层次免疫功能异常的自身免疫性疾病。大量研究证实，基因水平的免疫调节障碍及细胞因子代谢紊乱在 SLE 中表现突出，直接或间接地参与了 SLE 的形成和发生过程。近年来，随着基因分析技术的不断发展和相关研究的深入，一些 SLE 相关基因不断浮出水面，其中尤以 IFIT1 备受关注。有证据表明 IFIT1 在 T 细胞经 CD3/CD28 激活的信号传导通路中参与了细胞因子合成的调控，在 SLE 进程中起着举足轻重的作用[1，2]。本研究拟通过建立稳定过表达 IFIT1 的转染 T 细胞系，采用基因干预技术（RNAi）下调 IFIT1 的表达，检测有关免疫学指标，进一步阐明 IFITI 在 T 细胞中的功能。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
1.1.1 主要试剂 抗 CD3/CD28 单克隆抗体、PE 交联免疫细胞膜分子系列抗体、Percp 交联抗小鼠 Ig 抗体、细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ）、Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒、细胞增生检测试剂盒、RNAi 试剂盒及质粒抽提试剂盒购自晶美公司；Jurkat 细胞、IFIT1 的穿梭表达克隆和GatewayTM 表达质粒 pcDNA-DEST47 由中科院细胞库提供。
1.1.2 主要仪器 BD 公司的 FACSAria-TY2640 型全自动流式细胞仪、Amaxa 公司的电转导仪和 Biod 公司的全自动 iCYCLE 型荧光 PCR 定量分析仪。
1.2 Jurkat 稳定转染细胞系的建立
将 IFIT1 的穿梭表达克隆与 Gateway 表达质粒 pcDNA-DEST47 同时经兼容性的 LR 酶切，将 IFIT1 转入 pcDNA-DEST47，混合物转化入DB3.1TME.coli，经氨苄青霉素和氯霉素筛选阳性表达菌株，扩增培养后抽提质粒；同时制备仅表达 EGFP 的 pcDNA-DEST47 质粒，作为对照。采用电转导仪，分别将质粒 pcDNA/EGFP 和 pcDNA/IFIT1-EGFP 电转导入 Jurkat 细胞，48 h 后，加 G418 至终浓度 1200 g/mL，2 周后再经有限稀释筛选表达 EGFP 和 IFIT1-EGFP 蛋白的克隆细胞株 J/EGFP 和 J/IFIT1-EGFP，经荧光显微镜观察和定量 PCR 验证所得克隆为稳定表达细胞株，同时冻存细胞株备用。所用 IFIT1 的引物由深圳匹基公司合成，Forward：5’-GCCTCC TTTGGG TTCGTCTATAA-3’，Reverse：5’-TCAAAGTCAGCAGCCAGTCTCA -3’。
1.3 免疫生物学功能指标的检测
用 CD3 和 CD28 分别刺激克隆细胞株 Jurkat、Jurkat/EGFP 和 Jurka IFIT1-EGFP 后，进行下列免疫生物学功能指标的检测。
1.3.1 流式细胞仪检测细胞膜分子的表达 采用固相细胞刺激法，将 CD3（1 g/mL）和 CD28（2 g /mL）包被至 24 孔 Costar 板中，4℃ 孵育 8 h，每孔加入含 1×106 个细胞的 500 L 培养液，37℃，5% CO2 培养 3 d，细胞培养液经离心，留上清液检测细胞因子。细胞沉淀经洗涤和单抗染色处理后上流式细胞仪检测膜分子的表达。
1.3.2 细胞因子的定量检测 细胞培养液上清液细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10、IFN -γ）的检测严格按照试剂操作说明书进行。
1.3.3 细胞增生功能的检测 采用非放射性染料 CSFE 标志核酸的方法，分别将 3 种细胞株调整至 6×106 个/mL，快速加入 5 nm 的 CSFE 1 L，混匀后加至包被 CD3（1 g/mL）和 CD28（2 g/mL）的 Costar 板中，每孔 300 L，37℃，5% CO2 培养 96 h 后，上流式细胞仪检测。
1.3.4 细胞凋亡的检测 制备含 10-4 mol/L 地塞米松的培养液，用该液将 3 种细胞株调整至 l×l06 个/mL，每孔 1 mL，加至 24 孔 Costar 板中，37℃，5% CO，培养 7 h 后，按 Annexm V-FITC 凋亡检测试剂说明书操作，上流式细胞仪检测。
1.4 RNAi 的初步应用
1.4.1 有效靶序列的选择 从 GeneBank 中查到人的 IFIT1 的基因编码全长序列（Accession Number: M24594），按照网页上的要求设计靶序列特异的 RNAi（选择 IFIT1 的 mRNA 起始编码下游 4 个位点 195、653、1004 及 1241，每个位点长度为 19 个碱基，共 8 条序列），经 Blasr 验证后由深圳匹基公司合成。制备基因沉默的表达质粒按照产品操作说明书进行，经筛选扩增纯化。G418 筛选多克隆，再将 4 种基因沉没质粒分别转染过表达细胞株，用荧光显微镜及定量 PCR 检测 IFIT1-EGFP 的表达，挑选出下调幅度最大的（> 70%）沉默质粒进一步扩增。
1.4.2 下调 IFIT1 的 mRNA 后观察细胞因子的分泌水平变化 扩增培养 Jurkat/1FIT1-EGFP 细胞株，每 2 L 沉默质粒转染 2×l06 个细胞，48 h 后，用 CD3（1 g/mL）和 CD28（2 g/mL）刺激细胞株，3 d 后检测细胞因子的分泌水平，同时以空白沉默质粒转染的 Jurkat/IFIT1-EGFP 细胞株为对照。
1.5 统计学处理
所有资料均以均数±标准差（x±s）表示；差异的显著性检验采用 t 检验进行分析；P < 0.05 作为显著性界限。
2 结果
2.1 IFIT1-EGFP 稳定转染细胞系的建立
电转导 48 h 后，经荧光显微镜观察到约 40% 的细胞表达荧光，经 G418 筛选 4 周后形成几个克隆细胞株，为验证其中 IFIT1 的表达水平，应用荧光定量 PCR 法检测细胞株中 IFIT1 的 mRNA 含量，结果显示 Jurkat/IFIT1-EGFP 细胞株比 Jurkat/EGFP 细胞株明显增高，差异有显著统计学意义（P < 0.05）（表 1）。
2.2 细胞膜分子的表达
使用平均荧光强度（MFI）来表示细胞膜分子的表达水平。经流式细胞仪检测，3 个细胞株（Jurkat、Jurkat/EGFP 和 Jurkat/IFIT1-EGFP）之间，细胞膜分子的表达水平无显著性差异（表 2）。
2.3 CD3 和 CD28 刺激后细胞因子水平
3 个细胞株用 CD3（1 mg/L）和 CD28（2 mg/L）刺激 3 d 后，检测细胞因子的分泌水平，数据显示Jurkat/IFIT1-EGFP 细胞株的细胞因子 IL4 及 IL-10 的产量明显高于其它 2 个细胞株，而 IL-2 和 IFN -γ在 3 个细胞株间的变化并不明显（表 3）。
2.4 地塞米松诱导的细胞凋亡
3 个细胞株（Jurkat、Jurkat/EGFP 和 Jurkat/IFITl-EGFP）流式细胞仪检测，凋亡细胞百分比分别为8.75%、5.02%、6.13%，差异无显著性（P > 0.05）。
2.5 流式细胞仪检测细胞增生水平
在加核酸染料 CSFE 后，经 CD3（1 mg/L）和 CD28（2 mg/L）刺激 4 d 后，用流式细胞仪检测细胞增生程度,结果表明 IFIT1 对细胞的增生无明显影响。
2.6 Jurkat/IFIT1-EGFP 细胞株下调 IFIT1-mRNA 后细胞因子表达的变化
在下调 IFIT1 的 mRNA 后，Jurkat/IFIT1-EGFP 细胞株分泌 IL-4 和 IL-10 的能力相应下降，与未下调 mRNA 者相比差异有显著性意义（表 4）。
3 讨论
系统性红斑狼疮（SLE）是由遗传、性激素、感染、环境等因素相互作用引起机体免疫调节紊乱所致的一种自身免疫性疾病。由于细胞和体液免疫功能障碍，产生多种自身抗体，触发机体的免疫病理反应，血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体，最终导致多系统多器官功能受损。大量研究[3-6] 证实，免疫调节障碍在 SLE 中表现突出，大量自身抗体产生和丙种球蛋白升高，说明 B 细胞活动高度活跃；T 淋巴细胞绝对量虽减少，但T细胞亚群之间的比例普遍失调；白介素、IFN -α及 IFN -γ等细胞因子的代谢异常等。均提示体液免疫和细胞免疫调控机制的紊乱，直接或间接地参与了 SLE 的形成和发生的各个环节。
本项目实验资料提示，在 T 细胞经 CD3/CD28 激活的信号传导通路中，SLE 相关基因 IFIT1 参与了细胞因子合成的调控过程。国内外已有研究认为，SLE 存在严重的免疫调节紊乱，尽管 SLE 的病因未明，但观察发现在免疫炎症部位浸润有大量的活化 T 淋巴细胞，造成局部组织损伤。SLE 的免疫组织化学研究表明，在病变的血管和腺体等部位浸润着的主要是 CD4 T 淋巴细胞。自身免疫 CD4 T 细胞根据细胞因子分泌模式可分为 Th1 细胞和 Th2 细胞二个亚群。Thl 细胞主要分泌 IL-2 和 IFN -γ；Th2 主要分泌 IL-4 及 IL-l0。前者主要参与促进细胞免疫应答，后者主要参与促进体液免疫应答。Thl 细胞因子抑制 Th2 细胞，反之亦然。Thl 细胞能合成 IL-2、IFN -γ、LT、IL-3、TNF -α和 GM-CSF，即 Thl 型细胞因子；Th2 能合成 TNF -α、IL-3、GM-CSF、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-l3。这些细胞因子在调节免疫、激活分化其他免疫活性细胞、产生信号分子等方面发挥着重要作用[7]。正常机体 Thl/Th2 维持动态平衡，当 Th1/Th2 失调时，即为“Thl-Th2”漂移。不同的 Th1/Th2 具有不同的免疫效应。
国外有学者认为在自身免疫病中 Thl/Th2 失衡的特点是：器官特异性疾病如多发性硬化和克隆病是以 Thl 为主的病理免疫反应；而 SLE 和干燥综合征则是以 Th2 型的细胞因子为主导的免疫异常应答[8]。
IFIT1 是 IFN 诱导的蛋白，随着分子生物学和基因信息的丰富和发展，IFIT1 的序列和克隆均已方便获得[8-10]，但是其功能却报道不多。本研究在充分利用已有信息和材料的基础上，建立了 IFIT1 过表达的Jurkat细胞株，对经 CD3/CD28 抗体活化的细胞株进行了几项功能检测，发现 IFIT1 能促进 IL-4 和 IL-l0 这两种细胞因子的分泌，似提示 SLE 的发生发展与 Th2 方向的细胞因子关系更为密切，这一点还有待进一步的研究。
在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降低表达，以确定其功能。2001 年国外学者[11]首次利用 2l~23 bp 双链 RNA 实现了真核细胞中相应基因封闭，称之为小干扰 Na（small interference RNA）。siRNA 能够引导相应 RNA 酶结合到 mRNA 靶序列，使之降解。这种技术即为 siRNA 技术，也称基因沉默技术（gene silence）。由于 siRNA 具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失，它比反义 RNA 技术和同源共抑制法更有效，因此 siRNA 可以作为一种强有力的研究工具，研究目的基因的功能，短时间内，该技术就被应用于各种领域的实验研究中[12-13]，如抗HIV病毒、HCV 病毒、抗肿瘤等，成为一种有力的基因干预的手段。然而该研究方法存在一定的局限性，只能下调 mRNA 的表达，而不能像基因敲除那样完全阻断基因的表达。因此本研究使用的基因沉默技术只能部分下调 IFIT1 的 mRNA 的表达，不能了解 IFIT1 完全阻断后的细胞因子分泌的变化及格局。临床上已试用的生物制剂有细胞因子及细胞膜分子的拮抗剂，虽然有一定的疗效，但其非特异性和疗效的有限性使得临床医生迫切盼望更有效、副作用更小的药物。另一方面，迄今为止，狼疮的发病机制研究上未获突破，其中胞内信号传导通路知之甚少。因此，基于 IFIT1 在信号传导通路中可能的重要位置及其在 T 细胞的细胞因子分泌功能中的重要作用，提示 IFIT1 是很有潜力的临床药物靶点。自从干扰素应用于临床治疗以来，常有报道病毒感染者经干扰素治疗引起狼疮等自身免疫病的现象，其机制未明[l4]，因此本研究为探索 SLE 特定的异常发病通路，阐明发病机制，特异性治疗药物的开发利用奠定了基础。
【】
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