滑膜细胞凋亡在佐剂性关节炎大鼠关节炎症中的作用

【摘要】  目的：探讨成纤维样滑膜细胞凋亡在佐剂性关节炎（AA）大鼠关节炎症中的作用。方法：采用大鼠尾部皮内注射完全福氏佐剂（CFA）建立 AA 模型，注射 CFA 后第 14 日起，每隔 7 d 记录关节炎指数（AI），并每隔 7 d 引颈处死 1 组大鼠，组织块培养法分离培养 AA 大鼠膝关节成纤维样滑膜细胞，流式细胞仪检测成纤维样滑膜细胞凋亡；分析成纤维样滑膜细胞凋亡的改变与 AI 的相关性。结果：AI 在疾病早期逐渐增加，后期明显下降。流式细胞分析显示随 AA 病程延长 S 期滑膜细胞比例逐渐增加。在 AA 早期成纤维样滑膜细胞凋亡明显抑制，后期则凋亡抑制逐渐减弱，凋亡抑制与 AI显著相关。结论：在 AA 发病机制中，成纤维样滑膜细胞凋亡抑制可能在急性滑膜炎中起有一定作用。

【关键词】  实验性关节炎；成纤维样滑膜细胞；凋亡

    〔Abstract〕ObjectiveTo  explore  the  effects  of  proliferation  and  apoptosis  of  fibroblast-like  synoviocyte on  articular  inflammation  in  adjuvant  arthritis(AA).    Methods     0.1  mL  of  the  complete  Freud's  adjuvant  (CFA)  was  subcutaneously  injected  into  the  tail  of  Wistar  rat.  14  days  after  CFA  injection,  Arthritis  index  (AI) was  evaluated  every  7  days  and  a  group  of  rats  (6  rats)  were  executed  every  7  days.  Fibroblast-like synoviocyte  was  cultured  in  vitro.  The  amount  of  apoptotic  cells  and  cells  in  S-phase  was  measured  by flow  cytometry.  The  correlation  of  fibroblast-like  synoviocyte  apoptosis  and  AI  was  analyzed. Results     AI  was  increased  in  the  early  course  of  AA,  but  decreased  in  the  later  course.  Flow  cytometry  demonstrated  the amount  of  cells  in  S-phase  increased  with  the  course  of  AA  progressed.  The  increase  of  S-phase  cells  positively correlated to  the  increase  of  RI.  Apoptosis  of  fibroblast-like  synoviocyte  in  the  early  course  of  AA  was  significantly inhibited,  but  the  inhibition  attenuated  in  the  later  course.  Apoptosis  inhibition  was  positively  correlated  to  the increase  of  AI.ConclusionIn  the  pathogenesis  of  AA,  the  inhibition  of  fibroblast-like  synoviocyte  apoptosis may  take  a  role  in  acute  synovial  inflammtion.

    〔Key  Words〕    Experimental;  Arthritis;  Fibroblast-like  synoviocytes;  Apoptosis

      类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种常见的严重危害人类身心健康的多因素导致的系统性自身免疫性疾病，其病理机制的关键在于关节反复的炎症、滑膜细胞“肿瘤样”增生以及由此引起的软骨和骨质破坏，其中成纤维样滑膜细胞是关节滑膜细胞中主要的一种[1]。研究显示引起 RA 关节滑膜组织过度增生的基本原因可能是由于滑膜细胞凋亡机制障碍所导致的滑膜组织内细胞的增殖和死亡之间的平衡失调而引起[2]。本研究拟观察大鼠佐剂性关节炎（adjuvant arthritis, AA）不同时间点关节成纤维样滑膜细胞凋亡与炎症指数（AI）的关系，以进一步明确滑膜细胞凋亡在关节炎症中的作用，为合理诱导成纤维样滑膜细胞凋亡而 RA 提供理论基础。

    1    材料与方法

    1.1    主要试剂与仪器    完全福氏佐剂（complete Freud's adjuvant, CFA，Sigma 公司产品）；RPMI-1640 培养基（美国 Gibco 公司），胰蛋白酶（美国 Amreso 公司），Ⅱ型胶原酶（美国 Sigma 公司），新生牛血清（杭州四季青公司），碘化丙啶（PI，美国 Sigma 公司）。OLYPUSBX-60 光学显微镜（日本） 。流式细胞仪（美国 BectonDickinson 公司）。

    1.2    试验动物与分组    雌性 Wistar 大鼠 48 只，体重 125~155 g，6~7 周龄，购自中山大学实验动物中心。随机分成 7 组，每组 6 只，分笼饲养，室温（18±2）℃，相对湿度 45%~50%，空气新鲜，通风良好，自由摄食、饮水。

    1.3    大鼠 AA 的诱导    实验组（42 只）和对照组（6 只）大鼠 75% 酒精消毒后，于尾部中内 1/3 交界处分别皮内注射 CFA 和生理盐水各 0.1 mL，连续观察四肢关节红肿情况并于注射 CFA 后第 14 天起，每隔 7 d 根据关节红肿程度记录关节炎指数（AI）[3]。

    1.4    AA 大鼠膝关节滑膜细胞培养    无菌取出 AA 大鼠双侧膝关节滑膜组织，剪成 1~2 mm3 大小，用 D-Hanks 液反复漂洗 3 次。用弯头吸管吸取数小块均匀排列在培养瓶的底壁上，轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上，置 37℃、5% CO2 培养箱内培养 2 h，使其贴壁。取出培养瓶加入预温的 20% 小牛血清 RPMI-1640 培养液少许，使液体刚刚覆盖组织块为宜，再置 37℃、5% CO2 培养箱中继续培养。每隔 1~2 d 换营养液 1 次，待滑膜成纤维细胞长出组织块较多后，弃除组织块，继续培养，待细胞长满后，用 0.5 g/L 胰蛋白酶、0.2 g/L EDTA 消化细胞，进行传代培养，传代 2 次。

    1.5    流式细胞仪分析细胞周期及检测细胞凋亡    消化细胞并分别收集于离心管中，以 800 r/min  离心 5 min。弃上清，用冷 PBS 洗 2 次，加 700 mL/L 冷乙醇于 4℃固定过夜。再以冷 PBS 洗 2 次，调整细胞数为 1×106 个/L。各管加入 PI 染液于 4℃染色30 min，用流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡，以联机专用软件分析结果。

    1.6    统计学分析    实验数据用 x±s 表示（流式细胞分析结果将阳性率转换成阳性细胞数），采用SPSS 10.0 软件进行组间均数 ANOVA 方差分析，直线相关分析。P < 0.05 为差异有统计学意义。

    2    结果

    2.1    AA 大鼠膝关节滑膜的组织学观察    正常大鼠膝关节滑膜衬里层由 1~2 层滑膜细胞组成，且部分不连续，滑膜衬里下层则为脂肪细胞，未见炎症细胞浸润、成纤维细胞及胶原纤维；实验组大鼠 FCA 注射后第 14 至 49 天，可见滑膜衬里层逐渐增厚，衬里层细胞由 1~2 层逐渐增加至 10~15 层，衬里下层有大量炎症细胞浸润，脂肪细胞消失，可见大量成纤维细胞及胶原纤维，部分可见纤维素样坏死，新生血管明显增多，可见血管翳形成。

    2.2    AA 大鼠不同时间点的 AI 和 RI    AA 大鼠成模后，随着病程的延长，RI 逐渐增加。在发病早期，AI 逐渐增加，28 d 时达高峰，在疾病后期 AI 逐渐下降。（见表 1）。

    2.3    AA 大鼠不同时间点关节成纤维样滑膜细胞流式细胞仪细胞周期分析及凋亡检测结果    见表 2，流式细胞周期分析结果显示，随着疾病的，成纤维样滑膜细胞处于 S 期的细胞比例逐渐增加，处于 G1 的细胞比例逐渐减少（见图 1）。由于细胞周期中 S 期细胞为增殖旺盛细胞，而 G1 细胞分裂增殖相对停顿，说明随着疾病的发展，成纤维样滑膜细胞增殖活跃。在发病早期，纤维样滑膜细胞凋亡细胞比例逐渐减少，35 d 后凋亡细胞比例逐渐增加（见图 2）。对照组 S 期细胞及凋亡细胞比例均较低，说明正常滑膜组织细胞更新相对缓慢。

    2.4    成纤维样滑膜细胞凋亡与 AI 的相关分析结果    直线相关分析显示，凋亡细胞比例与 AI 显著负相关（r = 0.83，P < 0.01）（见图 3），即成纤维样滑膜细胞凋亡抑制，则 AI 增加。

    3    讨论

    类风湿关节炎是以多关节受累为主要表现的自身免疫性疾病，其主要病理特征是滑膜细胞（主要为成纤维样滑膜细胞）异常增生，衬里层增厚，炎症细胞浸润（巨噬细胞、T 细胞等），形成类风湿血管翳并侵蚀软骨与骨，最后导致关节破坏。RA 成纤维样滑膜细胞（fibroblast-likes synoviocytes, FLS）是关节滑膜细胞中主要的一种，被公认在 RA 病理演变中起着非常重要作用，它可以释放多种细胞因子，并可因 RA 关节微环境变化发生演变，呈现肿瘤样细胞的内源性活化，存在异常凋亡与增殖缺陷。不断积累的证据表明，RA 滑膜细胞凋亡缺陷是 RA 发病及病情的一个重要病理机制[5]。因而，对 RA 成纤维样滑膜细胞凋亡的研究，使我们对 RA 发病机制及病理过程有更深一步的了解，并提示我们能够以成纤维样滑膜细胞凋亡为靶点来合理设计新措施[6]，为 RA 的治疗开辟新的领域。

     然而，RA 为一种慢性进展性疾病，疾病的不同阶段，受累关节的病理变化及关节微环境亦不断变化，关节成纤维样滑膜细胞增殖及凋亡特性也可能有相应的改变。但目前有关 RA 疾病的不同阶段成纤维样滑膜细胞增殖及凋亡变化及其与关节病理改变的关系的研究尚未见报道。本试验观察了 AA 大鼠不同时间点关节成纤维样滑膜细胞凋亡的改变，并观察其改变与关节炎症指数（AI）的关系。结果显示，在 AA 的起始阶段，随着关节炎症的加剧成纤维样滑膜细胞凋亡明显抑制，随着急性炎症的消退，关节破坏等慢性病变的加重，成纤维样滑膜细胞凋亡的抑制逐渐减弱，细胞凋亡的抑制与 AI 显著相关。

    AI 是反映 RA 基本的病理变化，即关节滑膜炎的重要指标，AI 反映关节急性炎症。本实验结果显示，滑膜细胞凋亡抑制与 AI 有关。可能为在 RA 炎症起始阶段，滑膜细胞增殖信号尚未启动，但细胞的抗凋亡机制启动，并伴随滑膜细胞活化而分泌大量的促炎性细胞因子[8]，炎症因子进一步促进炎症细胞的聚集及滑膜细胞的增殖；随着疾病的进展，关节滑膜大量炎症细胞浸润,滑膜增殖能力逐渐增强，伴随血管翳的形成，导致关节软骨及骨质破坏的进展。

    总之，由本实验推论，在 AA 发病机制中，成纤维样滑膜细胞凋亡抑制可能在急性滑膜炎中起有一定作用，提示在探索以成纤维样滑膜细胞凋亡为靶点来治疗 RA 时需根据关节炎症及病理变化有所侧重。

【】
  〔1〕Huber LC, Distler O, Tarner I, Synovial fibroblasts: key players in rheumatoid arthritis. Rheumatology 2006, 45: 669-675

〔2〕Mahoney JA, Rosen A. Apoptosis and autoimmunit〔J〕. Curr Opin Immunol, 2005, 17(6):583-588

〔3〕Welles WL, Battisto JR. Suppression of adjuvant arthritis by antibodies specific for collagen type Ⅱ. Immunol Commun, 1981, 10(8):673-685

〔4〕Sloboda AE, Oronsky AL, Kerwar SS. Radiographic analysis of experimental rat arthritis. In: Greenwald RA, HS Diamond. Boca Raton, FL. eds. Handbook of animal model for the rheumatic diseases〔J〕. CRC Press, 1988. 159-164

〔5〕Firestein GS. Evolving conceptes of rheumatoid arthritis 〔J〕. Nature, 2003, 423(6937):356-361

〔6〕Reed J C. Apoptosis-based therapies〔J〕. Nat Rev Drug Discov, 2002, 1(2):111-121

〔7〕许赤多, 戴冽, 汤美安, 等. 大鼠佐剂性关节炎的诱导及观察指标比较〔J〕. 免疫学杂志, 2002, 18(2):140-141

〔8〕鲁静, 段宏梅, 沈晖, 等. 类风湿关节炎患者滑液中嗜中性粒细胞巨嗜细胞炎性蛋白1α表达水平及意义〔J〕. 中华风湿病学杂志, 2006, 10(3):133-136