人腹膜间皮细胞的体外培养

【摘要】  目的：建立简便有效的人腹膜间皮细胞（HPMC）的体外培养方法。方法：用 0.2% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTANa2 消化人大网膜组织，细胞悬液经 100 目筛网滤过后进行培养。用形态学、免疫组化（SP 法）鉴定细胞。结果：分离培养的细胞光镜下呈铺路鹅卵石状。免疫组化鉴定显示角蛋白、波形蛋白抗原阳性，第Ⅷ因子、白细胞 CD45 抗原阴性，证实培养的细胞的确是 HPMC。结论：胰蛋白酶消化法是一种简单实用的分离 HPMC 的方法。

【关键词】  腹膜间皮细胞；胰蛋白酶；大网膜

腹腔粘连是腹部手术后常见的并发症，常引起肠梗阻、慢性腹痛，以及不孕、不育等，而且粘连很难通过再次手术加以改善[1]。近年来对腹腔粘连的形成机制有了较深入的研究，认为腹腔粘连的形成与多种因素有关，其中腹膜间皮细胞的完整性及功能正常与否是腹腔粘连形成的关键因素[2]。因此，建立人腹膜间皮细胞培养体系，为体外研究人腹膜间皮细胞生理功能及其在腹腔粘连防治中的作用提供了有效手段。

    早在 20 世纪 80 年代初，Wu 等[3]通过直接从患者腹水中获取腹膜间皮细胞的方法，成功地培养出人腹膜间皮细胞。此后 Kern[4]和 Stylianou[5]等分别采用胶原酶消化组织法和直接种植法，培养出人腹膜间皮细胞，Stylianou 并完整地阐述了人腹膜间皮细胞的鉴定方法。虽然目前人腹膜间皮细胞培养方法很多，但由于培养人腹膜间皮细胞的条件苛刻且易受成纤维细胞污染等原因，要获得大量、高纯度的人腹膜间皮细胞仍为实验研究中的难题。我们综合方法并加以改进，建立了人腹膜间皮细胞体外培养方法。

    1    材料与方法

    1.1    取材

    无菌取自江苏省中普外科、肛肠科腹部手术切除的大网膜。

    1.2    主要仪器设备

    眼科剪、镊，培养皿，50 mL 培养瓶，吸管，10 mL 尖底离心管，CO2 培养箱，超净台，离心机，倒置相差显微镜，100 目不锈钢筛，0.22 滤膜过滤器。

    1.3    主要试剂

    1.3.1    PBS 液    氯化钠 8.0 g，氯化钾 0.2 g，磷酸氢二钠 1.56 g，磷酸二氢钾 0.2 g 溶于 1 000 mL 三蒸水中，过滤灭菌分装，室温保存。

    1.3.2    1640 培养基    Invitrogen Corporation 公司产品，按说明配制，并使其含有青链霉素各 100 U/mL，小牛血清 20%。

    1.3.3    细胞消化液    胰蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司）2.5 g，EDTA 二钠盐 0.16 g 溶于 1 000 mL PBS 液中，过滤除菌，分装于小瓶内，-20℃保存。

    1.3.4    免疫组化抗体    波形蛋白抗体，第 8 因子抗体，CD45 抗体均为福建迈新公司产品。

    1.4    腹膜间皮细胞的原代培养

    无菌摘取腹部手术切除的大网膜，剪取血管脂肪相对少的网膜组织，大小约 3 cm×3 cm，将剪取的网膜组织置于含 500 U/mL 青霉素和 500   L/mL 链霉素的无菌生理盐水中浸泡 20 min，然后用生理盐水流动冲洗 5 min，将漂洗后的网膜组织平铺于无菌培养皿内，再用 PBS 反复漂洗至没有油珠漂浮，同时剪除血管及脂肪，将洗净的网膜组织剪成 1 cm×1 cm 大小，加入 0.2% 胰蛋白酶 - 0. 02% EDTA 细胞消化液 20 mL，用吸管反复吹打均匀，装于 50 mL 培养瓶内，放置于 37℃，体积分数为 5% CO2 培养箱内消化 25 min，每 5 min 振摇 1 次，最后 5 min 保持静止。消化结束后将消化液用 100 目不锈钢筛过滤于培养皿内，加入等量含 20% 体积分数的胎牛血清的 RPMI-1640 完全培养液终止消化。用移液器分装于 10 mL 尖底离心管，1 000 r/min，离心 10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，分装于 50 mL 培养瓶，放置于 37℃，5% CO2 培养箱内培养。

    1.5    腹膜间皮细胞的传代培养

    原代细胞培养 24 h 后，镜下观察细胞贴壁情况，贴壁良好的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内全部陈旧培养液，贴壁情况差的以等体积的新鲜完全培养液替换瓶内一半的陈旧培养液，此后每 3 d 全换液 1 次。约培养 5~8 d 细胞生长融合，可以首次传代。当细胞生长融合成单层，PBS 漂洗 2 次，每瓶加入完全消化液 2 mL，在 37℃，5% CO2 培养箱内消化 15 min。镜下观察细胞消化情况，细胞脱落变形后，加入 4 mL 完全培养液终止消化。将细胞悬液分装于离心管内 1 000 r/min，离心 10 min，弃上清，加入适量完全培养液溶解细胞沉淀，传代于 6 孔板（将盖玻片裁成 4 片，泡酸，洗净，烘干，在盛有多聚赖氨酸的塑料培养皿内浸泡 5~10 min，取出，在干燥箱内 60℃烘干 1 h，高压灭菌。将灭菌后的盖玻片放置于 6 孔板内，每孔 3 片）内，加入适量完全培养液。继续在 37℃，5% CO2，湿度 95% 的培养箱中静置培养，至细胞完全贴壁伸展。

    1.6    腹膜间皮细胞的鉴定

    1.6.1    免疫组化鉴定    ①吸去 6 孔板内培养液，PBS（pH 7.2~7.4）洗 2 次，每次 3 min，将细胞爬片取出，用生理盐水洗 2 遍，随即放入 10% 中性福尔马林固定 30 min；蒸馏水洗 4 次，每次 3 min。②加入 0.1% TritonX100（PBS pH 7.4 配制），室温 10 min，PBS 洗 3 次。③抗原修复，根据不同一抗的要求进行（CD45 无须修复，波形蛋白和第 8 因子用柠檬酸缓冲液高压加热修复。滴加即用型一抗、室温下孵育 60 min BPS 洗 3 次每次 5 min，去除 PBS。每张盖玻片滴加 50   L  Elivision 试剂盒中的试剂 A，室温下 20 min，PBS 洗 3 次，每次 3 min。每张盖玻片滴加 50   L Elivision 试剂盒中的试剂 B，室温下 30 min，BPS 洗 4 次，每次 5 min）。④DAB 显色，每张盖玻片滴加新鲜配置的 DAB 显色溶液，在显微镜下观察 3~10 min；自来水洗 5 min，苏木素复染，0.1% 盐酸分化，自来水冲洗，PBS 返蓝。⑤脱水，逐级脱水：过 70%、80%、90%、95% 酒精各 1 次，100% 酒精 2 次，每次 1 min；透明，过二甲苯溶液 3 次，每次 3 min。⑥封片，将有细胞的一面向下，用中性树胶封片。通风干燥。普通光学显微镜观察，拍照。

    1.6.2    扫描电镜鉴定    ①细胞准备：同间皮细胞传代，取出细胞爬片浸入 PBS 中漂洗细胞表面；②固定：将细胞爬片放入青霉素小瓶中，加入 4℃预冷的 3% 的戊二醛，4℃过夜。吸出固定液，用 PBS 浸洗 2 次，每次 10 min。再加入 4℃预冷的 1% 的四氧化锇，在 4℃固定 1 h。PBS 浸洗 2 次，每次 10 min。③脱水：用 30%、50%、70%、80%、90%、100% 酒精逐级脱水，各 10 min。④置换：将样品放入醋酸异戊醋:丙酮 = l:1 的混合液中 10 min，然后放入醋酸异戊酯中 2 次，各 10 min；⑤临界点干燥：预冷临界点干燥室的样品室，使其温度降到 0℃，将玻片放入样品篮，样品篮的上下两面事先铺好滤纸，在保证细胞被醋酸异戊醋浸润的情况下，将样品篮放入样品室。拧紧室盖，充入液态 C O2，同时缓慢排出 CO2 气体，反复 3 次，使液态 CO2 置换出细胞中的醋酸异戊醋，加热样品室，使 CO2 达到临界状态。缓慢的排出 CO2，待样品室压力降为零，取出样品。⑥离子溅射镀膜：从样品篮中取出玻片，用银胶将干燥样品粘到样品托上。

    导电胶干燥后，将样品托放入离子溅射仪的真空罩内，抽真空。当真空度达0.1 托后，加高压 1 000 V，离子溅射镀膜。⑦电镜观察：启动扫描电镜，安装样品，观察细胞表面结构，拍照。

    1.6.3    透射电镜鉴定    ①消化间皮细胞，1 000 r/min，离心 5 min，3% 戊二醛固定，PBS 洗涤 2 次，每次 20 min；②1% 锇酸固定 30 min，PBS 浸洗 2 次，每次 10 min；③脱水：用 30%、50%、70%、80%、90%、100% 酒精逐级脱水，各 10 min；④100% 丙酮固定 10 min；Epon812 浸泡、包埋；⑤LKB-V 型超薄切片机切片（70   m）；H-600 透射电镜（日本）下观察、拍片。

    2    结    果

    刚从大网膜消化下来的间皮细胞在倒置显微镜下为葡萄串状，50% 的间皮细胞大约 24 h 左右贴壁，个别细胞伸展。72 h 所有贴壁细胞均伸展，呈多形性（梭形、椭圆形、多角形等），边缘不整，细胞呈现拉网状生长，与相邻的细胞相互连接。以后细胞拉网生长现象减少，生长融合呈多角形，大小较为一致，似铺路鹅卵石样外观。细胞经传代培养后，2~4 代细胞的形态与生长方式与原代细胞基本无异。5 代开始间皮细胞增殖明显缓慢。

    2.1    免疫组化鉴定

    光镜下观察所培养细胞的波形蛋白染色为阳性，是间皮细胞的特征。波形蛋白抗原阳性， CD45、第 8 因子抗原阴性可排除成纤维细胞、血管内皮细胞和白细胞。

    2.2    超微结构

    扫描电镜下细胞完全铺展，与周围对比不强烈。细胞呈椭圆形或多角形，胞核圆形，位于细胞中央、较小，有核处细胞隆起较厚。细胞表面大量密集的微绒毛，细胞周围高密度的绒毛在背景中形成高密度的晕圈。透射电镜检查：细胞表面存在大量多少不等的微绒毛，细胞浆内丰富的内质网和线粒体，未见 Weibel palade 小体。

    3    讨    论

    间皮细胞培养中要注意以下几点：①正确确定首次换液时间，避免换液过早，首次换液越晚越好，最好第 3 天进行，动作轻柔，减少振荡。原代培养头 3 天尽量勿动培养液，以免干扰间皮细胞贴壁，换液越早丢失的间皮细胞数目越多；②胰蛋白酶消化后，消化液中的间皮细胞不要，因为最先消化下来的往往是活力不好的细胞。终止消化后用培养液吹打下来的细胞活力好，生长快；③注入培养瓶中的间皮细胞要具备一定细胞密度，不要太稀。生长良好的细胞可提供“化学信使”去促进其它细胞生长，因此细胞密集时它们彼此能提供和接受该“化学信使”越长越好；假若过稀，则可因缺乏该化学信使而停止生长、死亡。此外，腹膜供体的年龄越年轻越好。

    虽然目前国内、外的已介绍了多种间皮细胞的培养方法，但这些培养方法均较为复杂且重复性不高，不能满足研究的需要。本实验所建立的体外人腹膜间皮细胞培养模型，操作简单，培养迅速，4~7 d 即可传代，可重复性强。

【文献】
  〔1〕Miller G, Boman J, Shrier I, et al. Natural history of patients with adhesives mall bowel obstruction〔J〕. Br J Surg, 2000, 87:1240

〔2〕刘洪斌, 李东华, 郭世铎. 腹腔粘连形成机制及研究进展〔J〕. 中西医结合外科杂志, 2005, 11(1):84-86

〔3〕Wu YJ, Parker LM, Binder NE, et al. The mesothelial keratins: a new family of cytoskeletal proteins identified in cultured mesothelial cells and nonkeratinzing epithelia〔J〕. Cell, 1982, 31:693

〔4〕Kern PA, Knedler A, Eckel RH. Isolation and culture of microvascular endothelium from human adipose tissue〔J〕. Clin Invest, 1983, 71:1822

〔5〕Stylianou E, Jenner LA, Davies M, et al. Isolation,culture and characterization of human peritoneal mesothelial cells〔J〕. Kidney Int, 1990, 37:1563