探讨复方丹参注射液对氧化所致损伤的血管内皮细胞的保护作用

【关键词】  复方丹参注射液；,,血管内皮；,,扫描电镜

　　摘要：目的探讨复方丹参注射液对氧化所致损伤的血管内皮细胞的保护作用。方法采用脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein cells)，用倒置相差显微镜和扫描电镜观察各组内皮细胞（endothelial cell, EC）的形态学特点。分光光度计测定细胞上清液中丙二醛的含量。结果扫描电镜观察显示过氧化氢组EC皱缩变小，细胞表面干裂，表面微绒毛减少甚至消失，细胞间隙增宽，而经丹参预处理过的过氧化氢组细胞形态结构则明显改善。MDA含量测定表明过氧化氢组的MDA含量明显增高。相反，正常组和丹参组中MDA含量减少（P<0.01）。结论 复方丹参注射液通过其抗氧化作用，对氧化所引起的受损血管EC有保护作用。

　　关键词：复方丹参注射液；  血管内皮；  扫描电镜
   
　　心血管疾病是人类死亡的首要原因。在各种心脑血管疾病中，很多都是由动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）而引起。而许多研究表明血管内皮细胞（endothelial cell, EC）损伤是AS发生的始动环节［1］。因此保护血管内皮对防治AS具有重要意义。 本实验通过扫描电镜观察细胞的超微结构，用分光光度法检测MDA含量,以探讨丹参对受损伤的血管EC的保护作用，以及其抗AS的作用机理。

　　1  材料与方法

　　1.1  药物与试剂复方丹参注射液（含丹参1 g/ml）为上海中西药液股份有限公司产品，批号021001；M199培养基为美国GIBCO公司产品；胎牛血清为美国HYCOLONE公司产品；MDA试剂盒为北京邦定公司提供；扫描电镜为日本产品。

　　1.2  人脐静脉内皮细胞培养按Jaffe等［2,3］人的方法略加修改进行。在无菌条件下，取健康产妇的脐带， 灌注0.1%Ⅰ型胶原酶（collagenase-Ⅰ）10 ～15 ml，置37℃水浴中孵育15～20 min。1 000 r/min离心10 min，沉淀中加入含有20％FBS的完全M199培养液5 ml，充分混合制成细胞悬液，以（1.5~2.0）×104/cm2密度植入培养瓶中，置37℃，5％的CO2培养箱中培养，定期换液，待细胞长成融合状态后进行鉴定及进行实验。

　　1.3  实验分组及药物处理实验分为3个组：①正常组：加入含20％FBS的完全培养液培养；②H2O2组：首先加入含20％ FBS的完全培养液，待细胞基本融合时再加入终浓度为75 μmol/L的H2O2刺激4 h；③丹参组：加入含20％ FBS的完全培养液，培养24 h后，再加入终浓度分别为0.125，0.25 ，1.25 ， 2.5 mg/ml 和12.5 mg/ml的复方丹参注射液，继续培养24 h后再加入终浓度为75μmol/L的H2O2刺激4 h。

　　1.4  用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞生长情况选用生长良好的HUVEC，制成细胞悬液接种于预置盖玻片的24孔板中，每孔加入（1～2）×105个HUVEC，放置于37℃，5％的 CO2培养箱内，含20％FBS的M199培养液中培养。待细胞生长呈亚融合状态后 各组按上述方法处理。取出玻片，放入3％戊二醛固定1 h，PBS洗3次，1％锇酸固定，PBS洗3次，梯度酒精脱水，用CO2临界点仪进行干燥，用离子溅射仪喷金，日立S3500N扫描电镜观察。

　　1.5   丙二醛（MDA）含量测定选用生长良好的HUVEC，制成细胞悬液，以浓度（1～2）×105/ml接种于24孔培养板。每组8个孔，设置7个组。细胞处理同上，终止培养并分别收集所有孔的上清液1 ml，置于20℃冰箱待测，然后按照北京邦定生物技术有限公司提供的试剂盒说明，用分光光度计检测MDA含量。

　　1.6  统计学处理所有实验数据用Excel统计软件进行统计分析。所有数值均以±s表示,组间比较用t检验进行统计学分析。

　　2  结果

　　2.1  内皮细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察，正常组EC生长旺盛，呈上皮样贴壁生长，细胞呈多角形或长梭形，呈鹅卵石样铺满底层。在75 μmol/L的 H2O2作用4 h后，细胞间隙增大，胞体变小，细胞收缩变圆，失去细胞间连接，胞浆透明，少数细胞悬浮脱落；随着作用时间进一步延长，胞膜边缘不清楚，部分胞膜不完整，细胞出现空泡和颗粒变性，细胞脱落增多，到将近4 h的时候出现拉网现象。而经丹参预处理过的H2O2组EC形态与正常组相似，并且浓度越高越接近正常细胞组。扫描电镜可以观察到正常组(图1)EC呈圆形或梭形、多角形，表面微绒毛丰富，排列规则，有光泽，细胞膜完整，细胞间隙较小，细胞连接可见。H2O2组(图2)的EC皱缩变小，细胞表面干裂，胞膜表面有孔隙，有的呈现不规则锯齿状，表面微绒毛减少甚至消失，细胞间隙增大，微绒毛僵直断裂，分布不规则，减少甚至消失，可见微绒毛水肿。而丹参组(图3)的EC形态结构则明显改善，其形态、大小及微绒毛数量、分布与正常组相似。

　　图1  正常组EC（Bar=15μm）(略)           

　　图2   H2O2组EC（Bar=6μm）(略)           

　　图3  丹参组EC(Bar=30μm)(略)

　　2.2  各组细胞培养液中MDA的检测结果用H2O2 刺激细胞后，细胞培养液中的MDA含量明显升高，而用复方丹参预处理的细胞培养液中的MDA含量与正常组相似。H2O2组与正常组和丹参组比较具有显著性差异（P<0.01）。结果见表1。

　　表1  各组内皮细胞中丙二醛含量的比较(略)

　　与H2O2组作比较，*P <0.01，n=8

　　3  讨论

　　动脉粥样硬化是引起各种心血管疾病的主要原因。引起动脉粥样硬化的因素很多，其中“炎症-反应”学说［4］是最受人们关注的。 研究表明［5］体内许多因素可损伤VEC，以活性氧最重要。活性氧除能使VEC膜脂质、蛋白质、核酸等氧化破坏外，并可氧化修饰低密度脂蛋白，进而更加促进AS的。中提出［6］H2O2是活性氧，可促进自由基生成。生物体内过氧化氢如不及时被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶消除，它可通过细胞膜，在膜外与Fe2＋或Cu2＋生成羟自由基OHo，从而引发脂类过氧化而导致细胞损伤。本实验的扫描电镜观察结果显示H2O2组内皮细胞明显受损，细胞明显肿胀及微绒毛消失等超微结构上的变化。而丹参组 的内皮细胞在超微结构上无明显变化，与正常组相似。表明丹参对受损伤VEC具有保护作用。生化学检测MDA含量常常反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，而通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中的一些能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。中医理论认为，丹参具有活血化淤、调经止痛、养血安神、凉血消肿等功能，而且有关丹参的抗氧化作用已经得到人们的重视。徐东坡等［7］人研究结果表明，丹参对氧自由基清除酶SOD的保护作用优于亚硝酸钠。实验结果与许晶兰等［8］人做的实验结果基本相符。本实验发现H2O2使VECs的脂质过氧化产物增加，而预先加入丹参可减轻VECs的氧化损伤, 细胞损伤不明显。丹参可能通过清除氧自由基的作用稳定细胞膜结构，从而减轻H2O2的氧化损伤作用。总之， 本研究结果表明复方丹参注射液具有保护由过氧化氢所致损伤的血管EC的作用，从而起到抗AS的目的，其机理可能与丹参抗脂质过氧化作用有关。

　　文献：

　　［1］   Ross.The pathogenesis of atherosclerosis-anupclate［J］.N Eng J Med, Feb 20 1986,314:488.

　　［2］  Basavaraju SR,Jones TD.Atherosclerosis risks from  chemicals:part 1.toxicological observations and mechanisms of atherosclerosis［J］.Arch Environ Contam Toxicol, 1998,35：152.

　　［3］  何作云.提高冠心病的防治水平，重视血管内皮功能损伤的研究［J］.血液流变学杂志，2002，12（3）：161.

　　［4］   Ross R, Atherosclerosis -an inflammatory disease［J］. N  Engl  J med. 1999, 340 (2):115.

　　［5］  任德成.综 述血管内皮细胞的氧化性损伤机理［J］.心血管病学进展，2002，23（4）：235.

　　［6］  林  蓉，刘俊田，李  旭，等.槲皮素对血管内皮细胞损伤的保护作用［J］.中国微循环杂志，2000，15（5）：304.

　　［7］  徐东坡，张军平，张文志，等.丹参注射液对血管内皮细胞氧化损伤保护作用的实验研究［J］.天津医科大学学报，2001，7（1）：21.

　　［8］  许晶兰，王孝铭，王冬霞.复方丹参滴丸对过氧化氢损伤的血管内皮细胞的保护作用与机制［J］.中国病理生理杂志，2005，21（8）：1659.