基于胶体金检测方法的蛋白芯片体系的建立

【摘要】  目的 构建一个检测尿液中HCG抗原的蛋白质芯片初级模型；方法 在硝酸纤维素膜上包被HCG单克隆抗体（抗β-HCG），加尿样后，标本中HCG抗原(标准品)与硝酸纤维素膜的抗体特异结合，再加入胶体金标记的单克隆抗体（抗α-HCG）,使其特异结合，完成对标本中抗原的染色。最后应用芯片扫描仪对光学信号的灰度值进行分析，从而绘制出标本中不同浓度的HCG对光学信号灰度值的标准曲线；结果 与现有方法相比，该方法将检测的最低浓度降至25 mIU/ml，具有良好的梯度、线性关系和重复性。结论 该方法是一种快速、简便、有较强操作性的检测HCG的方法。
【关键词】  免疫金染色；HCG；蛋白质芯片；双抗体夹心法； 光学信号灰度。
    Faulk和Taylor等［1］首次（1971年）将“胶体金标记”引入免疫化学创立了免疫金染色法(Immuno-Gold Staining IGS)。该标记物为纳米级金颗粒，具有良好的生物兼容性；金颗粒表面带有负电荷，因其静电的排斥力，故在水中能保持稳定，形成稳定的胶体［2］。该技术现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等［3］。免疫金染色法具有与酶联免疫吸附试验(ELISA) 相似的特异性和灵敏性,且快速简便,操作性强，检测结果可靠［4］。在当今的生物标记分析领域中，生命技术与与纳米技术的相互渗透与融合已为重要的前沿研究领域之一［5］。蛋白芯片将具有高度亲力和特异性的分子探针（例如单克隆抗体）点样在固相载体上，用于识别复杂样品（如血液、尿液等）中的目标多肽，再以胶体金标记的单克隆抗体（或者二抗）与样品中目标多抗特异结合后，用激光共聚焦扫描或CCD对信号的强度进行检测，从而判断样品中靶分子的数量。与传统的凝胶电泳、Westerblot及ELISA等相比, 蛋白芯片更为快捷、高效、并行、高通量［6～9］。与其他已问世的、抗原检测抗体的蛋白芯片不同的是，本研究所涉及的蛋白芯片是通过抗体检测抗原，更为直接、客观和特异性高。
    1  材料与方法
    1.1  试验材料
    1.1.1  实验试剂  HCG单克隆抗体（CD280,购于杭州隆基生物科技有限公司）,HCG抗原(国家标准品的HCG，购于生物制品检定所)，稀释用尿样(健康男性尿液)，氯化钠（西安化学试剂厂），磷酸二氢钠（天津红岩化学试剂厂），磷酸氢钠（天津红岩化学试剂厂），吐温（TWeen?20,西安化玻站试剂厂）,氯金酸(上海试剂一厂),氯甲硅烷 (西安化学试剂厂),氯仿(西安化学试剂厂),小牛血清白蛋白(AMRESCO.Ohio.USA),氢氧化钠(西安化学试剂厂),盐酸(西安化学试剂厂),去离子水(西安联尔科技有限公司)。
    1.1.2  实验材料  硝酸纤维素膜（Whatman Schleicher&Schuell公司Protran硝酸纤维素膜），芯片阅读仪（BA-85 孔径0.45 μm，西安联尔科技有限公司），单点盒（西安联尔科技有限公司），垫料（普通用卫生纸）。
    1.2  反应体系的建立
    1.2.1  磷酸缓冲液  TWeen-20(PBST):NaCl 9 g +Na2HPO4·12H2O 2.9 g+NaH2PO4·2H2O 0.2964 g+ 10% TWeen?20 2 ml+去离子水998 ml，平衡至室温再应用；胶体金标记的HCG单克隆抗体（α-HCG）［10］（由西安联尔科技有限公司制作提供），4 ℃ 避光保存，配制好后至少平衡2 d再应用，用时稀释成1:3的稀释液；0.05 M pH7.4 0.2%BSA?TBST封闭液：Tris 2.42 g+NaCl 3.5 g+10%TWeen?20 0.6 ml+0.8 gBSA+去离子水至300 ml，调整pH 7.4后，加去离子水至400 ml。
    1.2.2  不同稀释浓度的标准品配置  将HCG标准品分别用阴性尿液稀释为300 mIU/ml、200 mIU/ml、100 mIU/ml、50 mIU/ml、25 mIU/ml、0 mIU/ml。
    1.1.3  包被体系  将β?HCG以1%BSA稀释好，室温平衡30 min后，用微阵列打点机点样于硝酸纤维素膜上。质控点:羊抗鼠抗体以1%BSA 按体积比1∶10稀释；HCG单克隆抗体（β-HCG）:以1%BSA按体积比1∶2稀释。
    之后，待包被于硝酸纤维素膜上的样品干燥完全，24 h后，再用0.05M pH7.4 0.2%BSA-TBST 室温（约20 ℃）下封闭50 min,并制成斑点免疫滤渗试验单点盒。