菟丝子保护人精子冻存的初步研究
【摘要】 目的 中医具有完整的理论体系和大量的临床经验及有效药物，并在实践中证明确有成效。设想能利用中医理论指导，在中药中进行筛选精子冻存保护剂，不仅对辅助生殖具有重要意义，而且对中医，向多领域渗透以及对不育症患者都具有重要实用价值。方法 采用配对比较的实验方法。先通过预试验，选择相对较好的菟丝子液的浓度，为了减少多因素对实验的影响，保护液以甘油为主，并以三过蒸馏水、生理盐水、菟丝子水提浓缩液进行配置，保护液中的甘油含量均为14%，以是否含有菟丝子液区分为对照组与实验组保护液。并对数据结果进行统计，用配对t检验分析。结果 根据24份精液标本的检测数据，用SPSS软件进行配对组间分析，对两组精液标本的精子活率（a+b+c）进行统计比较，t=2.68,P<0.01，差异有显著性；对两组精液标本的精子活力（a+b）进行统计比较， t=2.45,P<0.05,差异具有显著性。结论 根据研究的统计结果，表明菟丝子在保护精子免受冷冻损伤方面具有一定的应用价值，既可以提高冻存后精子的整体活率（P<0.01），也可以增强精子冻存后的活力（P<0.05）。本实验为中医药与精子冻存相结合的广泛研究提供了可行性事例；开创了中医与辅助生殖之间新的结合点。
【关键词】 人精子 冻存 精子冷冻液 菟丝子 中医
菟丝子是男科临床不育症的常用中药，男科经常使用的保精片、萆菟汤、聚精汤系列方、菟丝子丸等都有菟丝子组成，且在男科不育症的治疗中效果较好。为了进一步验证菟丝子对精子的作用和扩展中医药在生殖领域的使用范围，加以人精子冷冻解冻中涉及中医药报道者极为少见，我们根据传统中医药学的基本理论，将温肾阳中药菟丝子放在人精子冷冻保护液领域中加以应用性地研究与探索，获取其保护人精子免受冻存损伤的效果。
1 材料
1.1 精液标本 精液标本均由南京医科大学生殖实验中心提供，鉴于精液冻存的实际需要和辅助生殖的发展水平，对精液标本的质量未作过高要求。由于未见到相关的标准，只是根据临床的实际情况，由个人私自制定。具体理由如下：目前的辅助生殖技术已可以实现卵胞浆内单精子注射，意思也可以理解为，从理论上只要有一个精子，就可以实现生殖愿望，加之部分病人的精子量，即使是在治疗阶段，依然会逐渐减少，而冷冻储藏人精子的目的就是为了辅助生殖或生殖保险的需要。原则上，只要病人有正常的精子就可以为其冻存，而本次实验的结果不会受到精液标本参数的太大影响，所以，采用了折中的办法。
精液标本的纳入要求：精液量>2ml；精子密度大于每毫升1千万；活力a+b>25%；畸形率<30%。
1.2 菟丝子提取液的制备 菟丝子药材由江苏省中药材科提供（厂商：安徽井泉集团中药饮片有限公司；批号：20060601），根据中药制剂的要求，在未知中药的具体有效成分的情况下以水提取物为宜，具体加工步骤如下。
1.2.1 煎煮水提 取干净菟丝子适量，加8倍蒸馏水浸泡30min，武火煮沸,文火再煮30min,滤布过滤,滤渣再加5倍量水同上法再处理2次,各煮沸30min,合并3次滤液。
1.2.2 沉淀净化 用冰箱静置沉淀，去除悬浮粒子（24h）。
1.2.3 浓缩 滤液于70℃水浴中浓缩至0.5g/ml(每m1药液相当于0.5g生药量)，冷藏保存备用。
1.3 试剂及设备 甘油（国药集团化学试剂有限公司，批号：F20060426），三过蒸馏水、生理盐水（南京医科大学生殖中心提供）；WLJY-9000伟力彩色精子质检机辅助精液分析仪（CASA），MACRO精子计数板，恒温水浴箱，冻存管，4℃冰箱，-80℃冰箱，液氮罐等。
1.4 人精子冷冻保护液 为了减少多因素对实验的影响，保护液以甘油为主，并以三过蒸馏水、生理盐水、菟丝子水提浓缩液进行配置，保护液中的甘油含量均为14%，以是否含有菟丝子液区分为对照组与实验组保护液，并对保护液的酸碱度与渗透压进行测定。
2 方法
采用配对比较的实验方法，将每一份经过检测的精液标本分为2份，一份放入对照组，另一份放入实验组，在每一份精液中加入等量的精子冷冻保护液并进行冷冻-低温存储-解冻复温等操作。具体操作流程如下。
2.1 预试验 通过预试验，选择相对较好的菟丝子液的浓度。用菟丝子液配置不同浓度的冷冻保护液，放入等量的相同精液标本，进行多次反复，选出保护精子效果较好的浓度，为正式试验的试剂配置作准备。
2.2 正式试验
2.2.1 流程设计 准备好各种试剂及设备后，进行操作流程设计，确定各个过程所需要的时间，计算好需要的各种数据，设定要防止的偏差，估计操作过程中可能出现的问题及差错，一并拟定好相应的补救措施。
2.2．2 冷冻保护液的配置 对照组保护液用甘油、三过蒸馏水及生理盐水进行调制，实验组的保护液用甘油、三过蒸馏水、生理盐水、菟丝子水提取液进行调制，两组的甘油含量相同，酸碱度相同（试纸法），渗透压无统计学差异（使用冰点渗透压测量仪）。
2.2．3 标本采集 病人或捐精者，采用手淫法常规取精，经常规检测后，指标符合纳入标准的精液，分成两份（各0.5ml），分别放入实验组与对照组。
2.2．4 平衡、降温及冻存 在两组标本中分别加入等量的实验冷冻液和对照冷冻液，用玻璃棒进行搅匀，然后放入4℃冰箱中进行冷平衡；冷平衡10min后，放入-80℃冰箱中进行降温冷冻20min，之后直接移入液氮罐中进行冷冻储存。
2.2．5 复温及检测 冻存于液氮罐中的精液标本，在冻存48h后，从液氮罐中取出，直接放入水浴箱中进行解冻复温（30min），复温后对标本进行数据检测。
2.2．6 对数据进行收集整理 对各项数据及时地进行收集整理，防止数据丢失，对有问题的数据进行必要的登记和调整，对实验的优缺点或问题进行初步的分析和记录，为数据的统计分析做好前期准备工作。
3 结果
初期选择精液标本30份，由于各种原因损失部分精液标本，回收并获得完整数据的精液标本24份。数据统计用SPSS软件进行配对组间分析。组间采用配对t检验（单侧），并导出数据表。见表1。表1 精液标本经冻存复温后的参数统计表对两组精液标本的精子活率（a+b+c）进行统计比较，t=2.68,P<0.01，差异具有显著性，结果显示菟丝子在人精子冻存方面具有显著保护作用，可以提高人精子的冻存活率。
对两组精液标本的精子活力（a+b）进行统计比较，t=2.45,P<0.05,差异有显著性，结果显示菟丝子在人精子冻存方面具有保护作用，可以提高人精子冻存后的活力。
4 讨论
4.1 现代医学对生殖的干预 随着人们的思想观念的更新，生活节奏的加快，环境污染的加重，婚龄及育龄的拖延，感染类疾患发病率的上升，以致不孕不育的发生率呈逐渐上升的趋势。据有关资料统计，欧美国家有15％、我国有10％左右的育龄夫妇不能生育，其中男性不育也占有相当大的比例（约占30％～50％），严重困扰着患者家庭生活，威胁着社会的稳定，已构成人们生活中的实际问题，对其进行有效的治疗，已成为一种社会的迫切需要。由于科学技术的发展，对不孕不育的治疗已从传统的内科药物治疗、外科手术治疗发展到目前的辅助生殖技术。辅助生殖技术是以治疗不育夫妇达到生育为目的的现代医疗技术，其中包括人工授精(AIH 或AID)、体外受精与胚胎移植(IVF-ET)、配子输卵管移植(GIFT)、单精子卵细胞浆注射(ICSI)等，在选择时，往往根据夫妻双方的实际情况而采用不同的辅助生殖手段。随着科技的发展，近10年来的辅助生殖技术也突飞猛进，单精子卵细胞浆注射、胚胎移植前基因诊断（PGD）、囊胚移植、卵母细胞体外成熟、配子及组织冻存等新技术对治疗不育产生了显著效果。
4.2 传统中医对生殖的干预 中医是以五脏为中心，阴阳五行为基础，贯穿整体、辨证等观点的传统医学理论体系，对生殖的干预，一样包含着预防、及康复的思想，并且具有悠久的。
在我国最早的文字甲骨文中，已有相当丰富的关于生育的方面的文字。如：孕字，好像妇女怀孕，腹中有子的形状；又如娠字，像女人大腹形状。晋唐时期的《针灸甲乙经·妇人杂病第十》已用针灸治疗女子不孕，其中有“女子绝子，阴挺出，不禁白沥，上寥主之”。《千金要方》有3卷、《千金翼方》有4卷专述与妇女特有或有关的疾病。唐代的本草，首次出现以功效作为药物的依据，依次介绍具有相同功效的药物，如世界上第一部由国家颁布的具有药典性质的《新修本草》中，就有无子功效之目，其下列有紫石英、阳起石、桑螵蛸、秦皮、石钟乳、紫葳、艾叶、卷柏等八味，可谓当时临床用药经验的。宋金元时期，妇产科在唐代基础上，正式独立成科，宋代的医学机构太医局设九科中，产科为其中之一。继后，中医生殖理论和实践逐渐丰富和成熟，明代的生殖医学日渐繁荣，相关的著作日益丰富，如薛己的《女科撮要》、万全的《万氏女科》与《万氏妇科达生编》、武之望的《济阴纲目》、杨谈的《女科杂言》、龚居中的《女科百效全书》、岳甫嘉的《医学正印女科》等；清代在明代的基础上，临证经验方面更见丰富，在辨证论治方面更为娴熟，著作也不断增多，如秦之桢《女科切要》、陈治《济阴近编》、傅山《傅青主女科》、叶桂《叶天士女科医案》等。新成立以后，中西医结合在妇产科领域内也结出了丰硕成果，20世纪60年代开始，认为“肾-冲任-天癸-胞宫”与“下丘脑-垂体-卵巢轴”的生理功能极为相似，因而用“中药人工周期”治疗闭经。之后，应用到无卵性不孕。至20世纪 80年代，中药人工周期疗法在临床应用增多，方法各异，均取得不少成功的经验。随着生殖医学的发展，人类的生殖方式不再全是而然的过程了。已可不经两性性交而用人为方法产生新一代个体，也即生殖工程或辅助生殖技术。
尽管古代医家对男子引起之不育已有一定认识，然而常把不育原因归咎于妇女，所以对男性不育症的研究远远不及对女子不孕之有成果。而江苏省中医男科，由于许履和、徐福松和何映等教授的理论开创和临床开拓，一直走在全国的前面，而他们对生殖的理论研究和临床实践也长期处于全国的领先地位，为后人研究生殖医学提供了大量的素材和理论依据［1］。
4.3 中医与辅助生殖的结合 随着体外授精胚胎移植及其衍生技术的不断发展，各种新的技术与手段也会不断涌现，而辅助生殖技术仍然会有很多问题需要解决。中医药学对不孕不育的治疗具有悠久的历史，《内经》云“肾气盛，天癸至，精气溢泻，阴阳和，故能有子”，那么对于现代的辅助生殖技术，中医是否可以发挥自己的独特功用呢。其实，无论是传统的中医还是较为发达的现代医学，都是通过治疗、干预、调节等来实现自己的功能的，在生殖方面也毫不例外。中医在科技相对不发达的过去积累了大量的经验并总结出了自己的理论体系，即使是现代的辅助生殖也仍然会有它的发展空间。如中医的三因、整体、辨证的观点，对现在的辅助生殖仍然会有一定的临床指导价值，中医与辅助生殖之间充满着很大的结合空间。
早在20世纪70年代就有人将人工授精的方法与中医药相结合治疗不孕症，并且较之单纯用中药或西药有较好的疗效 ，这是一种有益的尝试。随着科技发展，卵细胞浆内单精子注射技术和胚胎移植前基因诊断使辅助生殖技术更趋完善，但目前该项技术好象进入了“瓶颈阶段”，主要包括：卵巢反应低下和子宫内膜接受能力受限(即着床障碍)。张明敏等［2］运用银杏叶制剂治疗19例体外授精治疗中卵巢反应低下的患者，对照组(只用常规治疗)19例。结果表明，治疗组的卵泡数、卵细胞数和子宫内膜厚度均较对照组明显改善，治疗组的妊娠率为15.8％，其机制可能是改善了局部的微循环 。另一个影响孕育成功率的原因是着床障碍，胚胎着床是一个极其复杂的胚胎与子宫内膜之间的相互交流过程，由于伦的原因，人们对这一影响胚胎着床的关键知之甚少。目前，人们通常用观察血清雌激素的水平和子宫内膜的厚度来把握胚胎移植的时间，如此能够改善着床率，但是对着床障碍的诊断仍不尽人意。因此，中外学者运用中医辨证施治的理论，采用传统的针灸和中药着手，在胚胎移植前对母体进行干预，已经显示出很好的苗头。张明敏和Paulus等［3，4］采用随机对照的方法观察胚胎移植前后运用针刺三阴交、血海、足三里等穴位对患者临床妊娠率的影响，结果显示：针刺治疗组的临床妊娠率明显高于对照组(无针刺治疗)和安慰针灸组(相同穴位，安慰针灸针)，其机理可能与减轻胚胎移植时子宫内膜的收缩有关。张树成等［5］用中药补肾调经复方应用实验动物和不孕症患者，结果显示：该方不仅能使血管的生成增加，而且对着床期子宫内膜血管生成因子及其受体的表达增强，该结果为中医药促进胚泡着床提供了有利的证据，也为将中医药配合辅助生殖技术提高孕育成功率的研究提供了新的视角。
4.4 菟丝子与人精子冷冻保护 人精子冻存，是辅助生殖的常规技术之一，虽然人精子冻存方面取得了很好的成效，但仍然会对精子造成不同程度的损伤，为了研究更好的保护方法及冻存保护剂，生物医学界仍在作各种不同的研究、尝试或探索。而中医具有完整的理论体系、大量的临床经验药物，在几千年的实践中，证明确有成效。人精子当属中医的生殖之精，为“肾主生殖”的治疗范围，治疗的药物首先以“补肾”为原则，无论是考虑人精子“阳虚”不能耐寒，还是考虑“寒邪”太盛，都应该考虑温肾阳的中药。加之，中医的“内服”与“外治”使用的是相同的辨证体系，因此本次选择温肾阳的中药作为尝试或探索的开始。
菟丝子列为药用，早在《神农本草经》中就已有记载。其药用价值，《药品化义》叙述很详细：“菟丝子蔓延草上，无根假气而生，凝仲春正阳之气，方始结实，禀气中和，性味甘平。取子主于降，用之人肾，善补而不竣，益阴而固阳。又因味甘，甘能助脾，疗脾虚久泄，饮食不化，四肢困倦，脾气渐旺，则卫气自充，肌肉得养矣。”由此，可见菟丝子虽然是温肾阳的药物，兼有补肾阴的作用，且补而不峻、兼能健脾。现代研究也证实该药可以补肾壮阳、抗氧化、抗衰老，改善生殖系统功能，体外试验也表明可以显著改善精子的运动功能和膜功能。这些都为本次实验获得成功提供了理论支持［6～8］。
4.5 本次实验的作用 传统中医药内涵丰富，具有许多需要我们进一步研究和消化的内容，人精子冷冻解冻中涉及中医药报道者少见，我们根据传统中医药学的基本理论，将温肾阳中药菟丝子在人精子冷冻保护液领域中加以应用研究，具有的前沿性、临床实用性、技术可行性以及良好的发展前景。本课题只是一个小小的开端，中医药与人精子冷冻技术的结合还有很多工作要做，有待于生物医学的工作者更多地研究和探索。但由此也进一步验证了中医药与辅助生殖技术相结合具有极大的可行性和广阔的发展空间。
【】
1 李震．肾主生殖的现代实验研究．实用中西医结合杂志,1997，10(7)：625-626．
2 张明敏，黄光英，陆付耳，等．银杏叶制剂对体外授精治疗中卵巢反应低下患者的作用．中国中西医结合杂志,2003,23(3)：171-173.
3 张明敏，黄光英，陆付耳，等．针刺对胚胎移植怀孕率的影响及其机理：随机、安慰对照研究．中国针灸,2003,23(1)：3-5．
4 Paulus WE，Zhang MM，Strehler Erwin，et al．Influence of acupuncture on the pregnancy rate in patients who undergo assisted reproduction therapy． Fertil Steril, 2002，77：721-724．
5 张树成，刘效群，张志洲，等．补肾调经方药对人着床期子宫内膜血管生成因子及其受体的影响．中国中医基础医学杂志,1998,8(5)：384-386．
6 阎超.菟丝子的化学成分及药理作用研究概况.中国药物与临床,2005,5(9):683-684.
7 彭守静. 菟丝子、仙茅、巴戟天对人精子体外运动和膜功能影响的研究. 中国中西医结合杂志,1997,17（3）:145-147.
8 杨欣. 菟丝子水提物对人精子顶体和超微结构的保护作用. 中国中药杂志,2006,31(5):422-425.
