肾阴虚抑郁症大鼠模型的建立及评价

                          作者：陈晓阳，陈容，李晟，吴晓军，徐爱良，史冰

【摘要】  目的 建立肾阴虚抑郁症大鼠模型。方法 将50只大鼠随机分为正常组、单纯应激组、温燥组、甲状腺素组及激怒组；采用慢性温和不可预见性慢性应激建立抑郁症“病”模的同时，正常组、单纯应激组灌胃生理盐水，甲状腺素组灌胃甲状腺素，温燥组灌胃温燥药；激怒组采用长期激怒法并灌胃生理盐水。使大鼠在抑郁的基础上表现出一定的阴虚“证”，以大鼠一般状态、敞箱试验、液体消耗试验、血清雌二醇（E2）、睾酮（T）及血浆环腺苷酸（cAMP）、环鸟苷酸（cGMP）作为检测指标，对各模型进行比较。结果 与正常组比较，各模型组的体质量、水平得分、垂直得分、中央格停留时间、糖水消耗、总液体消耗各指标测值减少,温燥组、甲状腺素组及激怒组普遍出现活动减少，大便干燥，毛湿无光泽，易惊怒以及血浆cAMP含量升高，其中甲状腺素组和激怒组大鼠血清E2、E2/T比值显著升高。结论 甲状腺素合并应激抑郁模型所致的肾阴虚抑郁，更符合临床实际，简单易行，可作为肾阴虚抑郁症造模方法之一。

【关键词】  温燥药；抑郁症；肾阴虚；甲状腺素；动物模型；熟附片；肉桂；大鼠

    〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To establish a better experimental model of kidney-yin deficiency and depression syndrome. Methods All 50 rats were divided into normal, stress only, warm-dryness, thyroxine and irritation groups; all the rats were mildly and chronically irritated to establish the models of depression syndrome. The  rats was fed with normal saline in the normal and stress only groups, with thyroxine in thyroxine group and warm-dry medicine in warm-dryness group, and the rats in irritation group was irritated in long-term and fed with normal saline, which could cause rats in a depression state with kidney deficient syndrome. And all the general conditions, open-field test, fluid consumption, concentration of cAMP and cGMP in plasma, and concentration of E2,T in serum were detected and compared. Results Compared with normoal group, the targets in all groups, such as body weight, horizontal scores, vertical scores, stopping time in center, sugar water consumption and total body fluid consumption, were decreased, the motions of rats in thyroxine, warm-dryness and irritation groups were lowered with dry stool, easy irritation and increased serum cAMP concentration, in which, the ratio of serum E2, E2/T in thyroxine group and irritation group was increased obviously. Conclusion The odel of kidney yin deficiency and depression syndrome, induced by feeding thyroxine and irritated depression, is simple and prepared easily, which can be the first selection for the modeling of kidney yin deficiency and depression syndrome. 

    〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 depression syndrome; kidney yin deficiency; animal model; rats

    肾阴虚型抑郁症是由于长期情志不畅，以致耗伤阴精，肝肾阴亏，髓海不充所致，是抑郁症中比较常见的证型，尤其多见于疾病后期及中老年人群。近年来就抑郁症和肾阴虚证本质的研究较多，但对肾阴虚型抑郁症动物模型的研究尚未见报道。本文将3种阴虚证“证”模分别与慢性应激致抑郁症“病”模合并，建立3种不同的阴虚抑郁模型，试图寻找一种符合临床实际的肾阴虚抑郁症模型。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  健康SD大鼠50只，雄性，体质量（220±20） g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK（湘）2003-0001。

    1.1.2  药物及试剂  甲状腺素片（济南维尔康生化制药有限公司，产品批号：0505505），用蒸馏水配成浓度为0.25 mg/mL的混悬液；温燥药浓缩液（由湖南中医药大学第一附属提供），熟附片∶干姜∶肉桂按1∶1∶1 比例称取药材，提取挥发油后，水煎3次过滤，浓缩，兑入挥发油制成含生药1.5 g/mL的溶液；雌二醇（E2）、睾酮（T）放免分析试剂盒（北京科美东雅生物技术公司，批号050925），环腺苷酸（cAMP）、环鸟苷酸（cGMP）放免分析试剂盒（上海中医药大学同位素室，批号050920）。

    1.1.3  仪器  敞箱（自制）：由不透明材料制成，底面为100 cm×100 cm的正方形，被等分为25个等边方格，高50 cm；放射免疫计数器(GC-1200γ放射免疫计数器, 技术大学科技实业有限公司）；天平（型号:ES-C-600电子天平,湘仪天平仪器有限公司）；低温大容量高速离心机（型号：KDC-2046 低温大容量离心机,中国科学技术大学科技实业有限公司）。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组  试验前对所有大鼠进行敞箱实验和液体消耗实验，根据敞箱实验得分和液体消耗实验结果，将动物分为5组，每组10只：即正常对照组、慢性应激抑郁模型组（简称应激组）、慢性应激抑郁模型+温燥药（简称温燥组）、慢性应激抑郁模型+甲状腺素（简称甲状腺素组）、慢性应激抑郁模型+激怒（简称激怒组）。整个实验过程中动物自由摄食和饮水（禁食禁水应激除外)，室温(22±3)℃(热、冷应激除外)，昼夜节律光照，相对湿度60%~70%，背景噪音(40±10)db。

    1.2.2  3种肾阴虚型抑郁动物模型的建立  参照[1]方法并加以改进，8种应激因子随机安排到21 d中：①昼夜颠倒(24 h)；②禁食禁水(24 h)；③潮湿垫料、鼠笼倾斜；④40 ℃高温环境(5 min)；⑤夹尾(1 min)；⑥4 ℃冰水游泳(5 min)；⑦陌生异常物品(如塑料杯、木勺等)；⑧电击足底（18 V，5 s），除正常组外，各组大鼠均孤养并按程序给予应激刺激，造成大鼠抑郁。在应激使大鼠抑郁的同时，从试验第1天起，所有动物每天灌胃1次，连续21 d，温燥组[2]灌胃温燥药浓缩液；甲状腺素组[3]灌胃甲状腺素混悬液；应激组、激怒组和正常对照组灌胃生理盐水,各组灌胃容量都为10 mL/kg。激怒组参照文献[4]从第1天开始将大鼠双后肢束缚，成对吊在笼内，以引起激怒，首次20 min，以后每隔1 d，增加10 min。整个实验共21 d。

    1.2.3  观察模型动物一般状态及体质量变化  实验过程中观察大鼠外表、性情、活动情况、饮水量、大便情况。每周测1次体质量。

    1.2.4  液体消耗试验[5]  试验前在安静的房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h，2瓶均装有1％蔗糖水，随后的24 h，1个瓶装1％蔗糖水，1个瓶装纯水。23 h的禁食禁水后，进行动物的基础糖水／纯水消耗试验，同时给予每只大鼠事先定量好的2瓶水：1瓶1％蔗糖水，1瓶纯水。60 min后，取此2瓶并称质量。动物的总液体消耗、糖水消耗、纯水消耗、糖水偏爱=糖水消耗量/总液体消耗×100％)。每周进行1次糖水消耗试验。

    1.2.5  敞箱试验[6]  安静的房间内进行此项试验观察。将大鼠置于中心方格内，观察大鼠在5 min内中央格停留时间(s)、穿越格数(四爪均进入的方格方可记数，为水平运动得分)、后肢直立次数(两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分)、清洁运动记数、粪便粒数。彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察，每只观察1次。每周进行1次敞箱实验。

    1.2.6  大鼠血清E2、T及血浆cAMP、cGMP的测定  实验第22天，颈动脉插管取血，一部分血低温下自然退缩，按放免试剂盒说明书测血清E2、T；另一部分（约1~2 mL）注入含EDTA·Na2 50 ?滋L的试管中，摇匀放入冰浴中，1 h内，4 ℃,2 000 r/min离心10 min，按试剂盒说明书制备血浆样本，用于测定cAMP、cGMP。

    1.3  统计学分析

    SPSS 13.0统计软件包作为统计工具，计量资料用“ｘ±s”表示，方差齐者用单因素方差分析，方差不齐者采用Tamhan分析。

    2 结果

    2.1  各实验组大鼠一般状态的比较 

    造模2周后，各模型组均出现活动减少的情况，但是激怒组、温燥组和甲状腺素组还出现毛湿，毛无光泽、大便干燥、易激怒的现象。从饮水量来看，各组大鼠在实验初期都有降低趋势，应激组和激怒组这种趋势持续到实验结束，甲状腺素组、温燥组的饮水量经过短暂的减少后，有增加趋势，到实验第18天到达最高值，最后才有所减少，其中甲状腺组大鼠饮水量增加具有显著性，实验第21天甲状腺素组大鼠24 h饮水量显著高于正常组，见图1。

    2.2  各实验组大鼠体质量及行为学指标的比较

    实验前，各组动物测得的体质量、敞箱实验及液体消耗试验的各项指标相近，无统计学差异。实验第21天，应激组、激怒组、温燥组和甲状腺素组大鼠体质量显著低于正常对照组（P＜0.01）；各模型组的水平得分、垂直得分、中央格停留时间、糖水消耗、液体消耗等各项指标测值减少，与正常对照组比较有显著统计学意义（P＜0.01），见表1。

    2.3  各实验组大鼠血清E2、T及血浆cAMP、cGMP的比较

    与正常组比较，应激组大鼠血浆cAMP、cGMP及血清E2、T含量无统计学差异。与正常组和应激组比较，温燥组、甲状腺素组、激怒组大鼠血浆cAMP含量、cAMP/cGMP比值显著升高；温燥组E2、E2/T升高无显著差异，而甲状腺素组、激怒组大鼠血清E2、E2/T升高具有显著统计学意义（P＜0.01）。见表2。

    3 讨论

    抑郁症的病因尚未彻底阐明，目前认为慢性、低水平、长期的应激源是促进抑郁发生并加重病情的主要原因。慢性温和不可预见性应激抑郁模型根据此理论建立，已成为国内外广泛应用的动物模型。

    本实验采用3种阴虚证模（温燥药法、激怒法和甲状腺素法造模）分别合并抑郁症病模（慢性应激造模），以建立3种不同的阴虚型抑郁症病证复合模型，试图寻找一种更符合临床实际的肾阴虚抑郁症模型。采用经典的敞箱实验和液体消耗实验作为测量大鼠行为学改变及快感缺失的客观指标，评价其是否抑郁。实验可见，各阴虚抑郁模型组和单纯应激抑郁模型组大鼠体质量增加减慢，在规定时间内水平活动、垂直活动得分及清洁动作次数均较空白对照组明显减少，糖水消耗量降低，这说明模型组动物食欲减退、活动能力下降、兴趣丧失、快感缺乏等，表明抑郁模型复制是成功的。一般认为血浆cAMP升高是阴虚证的共有[7]，而血清E2升高、T含量降低是肾虚的特异性指标[8]。肾虚症状和阴虚症状并见作为肾阴虚的审证要点，那么也可以用肾虚和阴虚的客观指标来作为研究肾阴虚证的检测指标。温燥组、甲状腺素组、激怒组3种模型大鼠都出现血浆cAMP水平上升，cAMP/cGMP比值升高，而正常组和单纯应激组未见升高；再结合3种模型组大鼠大便干燥、毛湿无光泽、易惊怒等阴虚定性症状，说明温燥组、甲状腺组、激怒组大鼠在抑郁的基础上有了一定程度的阴虚表现。

    温燥药法是利用附子、肉桂、干姜温燥中药的温热作用，大补肾阳，阳热伤津耗液而致阴虚，同时结合应激抑郁模型，建立阴虚型抑郁模型。方法虽然简单，但类似于实热性亢奋状态，阳热伤及的主要是胃阴，故此法仅部分符合临床实际；从血清E2、T指标来看，温燥组大鼠血清E2、E2/T含量升高无统计学意义，因此该模型作为肾阴虚模型不太适合。

    激怒组应用长期激怒法，使“怒伤肝”，肝病及肾而致肾阴虚，结合慢性应激建立阴虚抑郁模型。虽然各血指标与甲状腺素组趋于一致，但是在饮水量方面，与其他组比较变化不同，呈减少趋势，这与阴虚内热证的症状有所不合；将动物倒吊令大鼠撕咬，长期会对大鼠造成身体上的伤害，使观察大鼠行为受到影响,且肾阴虚抑郁症属于情志疾病，情志受伤不代表身体上受到实质性的伤害，这容易混淆原发病和继发病的概念，因此也与临床不符；实验操作太过于复杂烦难，不利于模型的复制。

    甲状腺素组通过给实验动物大剂量使用甲状腺素，形成外源性甲状腺素水平升高，同时合并应激抑郁模型，复制出甲状腺机能亢进致阴虚抑郁症病证复合模型。实验表明：甲状腺素组大鼠饮水量增多，而体质量增长减缓，表明模型大鼠处于一种虚型亢奋的状态；大鼠易惊怒、大便干燥、毛湿无光泽、 捉拿时反应尖锐，与阴虚内热的表现较为相似；大鼠血浆cAMP水平上升，血清E2含量、E2/T比值升高，说明此模型存在着内在的肾阴虚。实验显示该模型大鼠在表现出部分抑郁行为的同时，也表现了一定的肾阴虚，在一定程度上模拟了肾阴虚型抑郁症状态。当然，甲状腺素+应激抑郁模型也存在一定的缺陷，如大鼠不能主诉肾的定位症状头晕目眩、腰膝酸软，那么对于肾阴虚“肾”的定位就只能通过检测相关的血液指标来确定。3种模型相比较而言，灌胃甲状腺素+应激抑郁模型所致的肾阴虚型抑郁症动物模型更能体现肾阴虚抑郁症的特点，比较直观，易被人接受，具有以下优点：①该模型利用甲状腺素可以提高动物基础代谢率的特点，造成大鼠的虚性亢奋，恰好符合了肾阴虚虚性亢奋状态的表现；②合并慢性应激建立抑郁模型，又符合了抑郁症中医七情致病的特点；③造模方法简便易行。因此灌胃甲状腺素加应激抑郁模型可作为肾阴虚抑郁症实验研究模型之一。

【】
  [1] A BeneLLi， M FiLaferro， A BertoLini， et a1． InfLuence of S-adenosy11L1methionine On chronic miLd stress-induced anhedonia in castrated rats[J]． British JournaL of PharmacoLogy，1999，127：645-654.

[2] 苗明三.实验动物与动物实验技术[M].北京:中医药出版社,1997:274.

[3] 陈小野.实用中医证候动物模型学[M]．北京：北京医科大学、中国协合医科大学联合出版社，1993：104.

[4] 樊蔚虹，岳广欣.长期激怒致肾阴虚证动物模型研制[J].中国中医基础医学杂志，2001，7（9）：707-709.

[5] 许 晶，李晓秋.慢性应激抑郁模型的建立及其评价[J].中国行为医学，2003，12（1）：14－17.

[6] 胡随瑜，彭贵军，宋炜熙，等.白松片对抑郁模型大鼠海马脑源性神经营养因子和酪氨酸激酶B表达的影响[J].中国行为医学科学，2005，14（4）：292-294.

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