瑞香狼毒提取物作用于人肺癌细胞NCI?H446[H446]后端粒酶的定量表达

【摘要】  目的：通过端粒酶的数量变化来探讨瑞香狼毒提取物对肺癌细胞NCI?H446[H446]的抗肿瘤作用。方法：体外培养肺癌细胞NCI?H446[H446]细胞株，以不同浓度的瑞香狼毒提取物作用24h后，用荧光标记的方法定量检测端粒酶。结果：瑞香狼毒提取物作用人肺癌细胞提取物NCI?H446[H446]后，端粒酶的数量明显减少并呈现与剂量的正相关性。结论：瑞香狼毒提取物对肺癌细胞NCI?H446[H446]具有明显的抗肿瘤作用。

【关键词】  人肺癌细胞NCI?H446[H446]；端粒酶；瑞香狼毒

    【ABSTRACT】  Objective:To investigate the effective value of Radix Euphorbiae fischerianae on human lung cancer cells NCI?H446 [H446] by changing the amount of telomerase.Methods:After the human lung cancer cells NCI?H446 [H446] were implanted,it was extracted by Radix Euphorbiae with different concentrations which would function for 24h.Then telomerase would be detected by fluorescence mark.Results:For human lung cancer cells NCI?H446 [H446] functioned by Radix Euphorbiae fischerianae,the number of telo? merase reduced apparently and appeared dependency of dosage.Conclusion:Radix Euphorbiae fischerianae has distinguished value for restraining human lung cancer cells NCI?H446[H446],and could be a new anti?cancer medicine.

    【KEY WORDS】  Human Lung Cancer Cells NCI?H446[H446],Telomerase,Radix Euphorbiae

    癌症是目前危害人类健康最严重的疾病之一，其中肺癌又是高发的恶性肿瘤之一。但目前的抗肿瘤药多为合成药，存在着毒副作用大、免疫抑制等不足等问题，寻找新的抗癌药物和方法，彻底治愈癌症已成为医学研究的热点。中药由于其毒副作用小，价格便宜等优点，逐步受到研究者的重视和关注。我们研究了瑞香狼毒提取物（1，5?二苯基1?1?戊酮）对人肺癌细胞NCI?H446[H446]克隆形成的抑制作用；为进一步探讨瑞香狼毒提取物在体外的抗肿瘤作用，我们通过检测端粒酶数量的变化来探讨瑞香狼毒提取物对肿瘤细胞的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  一般资料

    1.1.1  药物来源  瑞香狼毒采自河北北部，提取前经过专家鉴定确认。将瑞香狼毒晾干取其根部粉碎，装入容器中加入适量蒸馏水浸泡30min,加热提取[1]。制备成水体物，每克相当于生药6.6g。使用时用RPMI1640稀释。

    1.1.2  细胞来源  人NCI?H446[H446]小细胞肺癌细胞购自协和医科大学基础所遗传室。

    1.1.3  试剂  RPMI1640培养基、胎牛血清、噻唑蓝（MTT）为普京康生物科技有限公司产品；兔抗人TERT单克隆抗体、荧光标记阳抗兔IgG（FITC）由普京康生物科技有限公司进口分装；二甲基亚砜（DMSO）为天津市科密欧化学试剂开发中心产品。

    1.1.4  主要设备  超净工作台，倒置显微镜，恒温培养箱，水平离心机，流式细胞仪。

    1.2  方法

    1.2.1  分别设实验组、对照组和空白组。取25个25mL的培养瓶(培养瓶内细胞生长良好且数目满足1×106/mL)。实验组设3个浓度,加入不同剂量的溶于完全培养基的瑞香狼毒提取物溶液,每个浓度的样本数为5瓶,并设对照组和空白组,培养24h,用4℃缓冲液离心洗2次(去上清),用4%多聚甲醛1mL悬起细胞,室温孵育10min。用4℃缓冲液洗1次(去上清),加甲醇1mL悬起细胞,室温孵育10min。用4℃缓冲液洗1次(去上清),用0.2%TristonX?100液1mL悬起细胞,选用一抗稀释液100μL混匀室温避光孵育30min,4℃缓冲液洗1次(去上清)。选用荧光标记2抗稀释液100μL悬起细胞,室温避光孵育30min,用4℃缓冲液离心洗1次(去上清),用PBS缓冲液配制0.1%多聚甲醛250μL悬起细胞,4℃冰箱保存24h,上机测试。实验组加兔抗人hTERT抗体和羊抗兔IgG(FITC)各100μL及不同浓度的瑞香狼毒溶液；空白组加与实验组对应量的瑞香狼毒后加等量的PBS(pH7.4)代替一抗和二抗；对照组不加瑞香狼毒加一抗和二抗。

    1.2.2  荧光标记法  人肺癌细胞NCI?H446[H446]加瑞香狼毒提取物溶液后流式细胞仪定量检测荧光素标记羊抗兔IgG与兔抗人hTERT抗体结合hTERT蛋白表达。

    1.3  统计学处理  应用SPSS12.0软件进行统计学分析，采用组间比较t检验。

    2  结果

    瑞香狼毒提取物作用于NCI?H446[H446]细胞后端粒酶定量表达的变化见表1。从药物作用肿瘤细胞得出端粒酶量的均数可以看出,端粒酶数量的减少与作用的药物浓度正相关。且瑞香狼毒提取物对人肺癌细胞NCI?H446[H446]的作用呈剂量依赖性。表1中空白组数据只选取具有代表性的加1.5μg/L瑞香狼毒组。2008年6月刘  芳等：瑞香狼毒提取物作用于人肺癌细胞NCI?H446[H446]后端粒酶的定量表达第3期2008年6月河北北方学院学报（医学版）第3期表1  瑞香狼毒作用于人肺癌细胞NCI?H446[H446]后端粒酶定量表达变化(%)  （x±s)

    对照组空白组

    （1.5μg/L)实验组1μg/L1.2μg/L1.5μg/L瑞粒酶35.340±5.7440.015±0.00315.504±4.73910.476±1.9177.314±2.237P0.0050.0020.000

    注：表中P值为与对照组相比

    3  讨论

    瑞香狼毒是近年来在肿瘤化疗中备受关注的药物，在肺癌的化疗中被广泛应用，是目前晚期肺癌的最有效药物。瑞香狼毒含有多种化学成分，如：香豆素类化合物[2～5]、黄酮类化合物[6，7]、二萜类化合物[8，9]等，有研究认为，瑞香狼毒的抗肿瘤成分主要为瑞香狼毒水提取物(SCLA)[10～14]及尼地吗啉[15，16]。　瑞香狼毒对一些实体肿瘤的治疗效果也正在研究中，包括乳腺癌、前列腺癌。晚期肺癌的化疗效果不能令人满意，需要开发新的更为有效的的化疗药物或方案。

    真核细胞染色体末端含有串联重复的DNA序列称为端粒(Telomere),端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶,含有引物特性和识别位点,能以自身的RNA组分为模板合成DNA的TTAGGG重复序列,并加到染色体的末端以补偿细胞分裂时染色体末端的缩短。对肿瘤的研究发现,大多数癌细胞系和肿瘤细胞中端粒酶均有高水平表达,表明端粒酶的激活表达与细胞的无限增殖有密切关系[17，18]。那么控制端粒酶的激活,减少肿瘤细胞中端粒酶的数目,使其不再有保护端粒长度稳定不变的功能,从而达到抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的目的,可能会成为新的肿瘤治疗方向。

    本实验参照了流式荧光原位杂交术[19],使免疫组化技术与流式细胞术充分结合。从实验结果可以看出,瑞香狼毒可以抑制人肺癌细胞NCI?H446[H446]端粒酶的活性,具有明显的抗肿瘤作用,为今后瑞香狼毒用于肺癌的治疗提供了理论依据。本实验研究了瑞香狼毒对肺癌的抗肿瘤效果，其有效成分的具体作用机制还有待于进一步研究。

【】
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