糖基化终产物对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素3基因表达的影响

              作者：马婵娟，孙子林，金晖，杨涛，杨益宁

［摘要］　　目的：研究糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞半乳糖凝集素3 (galectin3)表达的影响。方法：将培养的人肾小球系膜细胞(HRMC) 用不同浓度(50、100、200及400mg・L-1)的AGEs干预24h或同一浓度(200mg・L-1)的AGEs干预0、24、48及72h，以无血清培养基(DMEM)和相应浓度的牛血清白蛋白（BSA）为对照。用RTPCR检测细胞中半乳糖凝集素3的mRNA水平。结果：不同浓度AGEs组HRMC的半乳糖凝集素3 mRNA水平与对照组相比均有显著差异（P＜0.01），且随着AGEs浓度的增高，半乳糖凝集素3 mRNA水平也逐渐增高(P＜0.05)；AGEs干预HRMC 24、48、72h，半乳糖凝集素3 mRNA水平与对照组相比有显著差异（P＜0.05），且随着干预时间的延长，半乳糖凝集素3 mRNA水平也逐渐增高 (P＜0.01)。结论：AGEs以时间及剂量依赖的方式促进HRMC半乳糖凝集素3 mRNA的表达。

　　［关键词］糖基化终产物；人肾小球系膜细胞；糖尿病肾病；半乳糖凝集素3；基因表达

　　Abstract：Objective  To study the effect of advanced glycation end products(AGEs) on the expression of galectin3 in cultured human renal mesangial cells(HRMC). Methods  The AGEsBSA was prepared by incubating bovine serum albumin(BSA) with glucose.The cultured HRMC were intervened with the same concentration of BSA and AGEsBSA(50,100,200,400mg・ L-1) for 24h or 200 mg・ L-1 AGEsBSA for 0,24,48 or 72h respectively. The mRNA expression of galectin3 in HRMC were analyzed by RTPCR.Results  Compared with that in cells incubated with DMEM and BSA,the level of galectin3 mRNA in cells incubated with 50,100 or 200,400mg・ L-1AGEsBSA respectively for 24h （P＜0.01）or with 200mg・ L-1AGEsBSA for 0,24,48 or 72h  respectively（P＜0.05）increased significantly. Moreover, with the increased concentration of AGEsBSA（P＜0.05）or the expanded incubating time （P＜0.01）,the level of galectin3 mRNA increased. Conclusion  The AGEsBSA can stimulate the expression of galectin3 in cultured HRMC in a concentration and timedependent manner.

　　Key words：advanced glycation end products; human renal mesangial cells; diabetic nephropathy; galectin3; gene expression

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是1、2型糖尿病的慢性微血管并发症之一，是引起终末期肾病的最常见病因［1］。大量研究表明，糖基化终产物（advanced glycation end products,AGEs）在DN的发生过程中起了重要的作用［2］。AGEs致病的主要机制之一是其可以与细胞表面的AGEs受体相互作用，引发生物学效应。半乳糖凝集素3（galectin3）是AGEs的受体之一［3］，它(AGER3)与p60(AGER1)、 p90（AGER2）被认为作为一个分子复合体（AGE受体复合体）起作用。本实验应用体外制备的AGEs对人肾小球系膜细胞（human renal mesangial cell，HRMC）进行干预，观察HRMC半乳糖凝集素3基因表达的改变。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料

　　牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，AMRESCO产品) ；D葡萄糖(分析纯，重庆北培化学试剂厂产品)；HRMC株为TSV40及Hras 原癌基因转染的永生系，保持了正常HRMC基本的形态学和生物学特性，由阮雄中博士（Renal Unit，Royal Free Hospital，LONDON，UK）惠赠；无血清培养基（DMEM）、HEPES为GIBCO公司产品；小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；TRIZOL、RTPCR试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis）、DNA Marker SM0241（80、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1031bp）、Taq酶均购自 Fermentas公司；半乳糖凝集素3及βactin引物由上海申能博彩生物工程公司合成；琼脂糖（电泳级）购自MDBio公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  AGEsBSA 的制备 

　　按照第一作者所在实验室常规［4］，将葡萄糖用0.02mol・L - 1PBS 溶液(pH 7.4)配成0.5mol・L- 1溶液, 加入BSA (浓度为5.0g・L- 1)，过滤除菌，37℃孵育3 个月，用PBS 溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA 除不加葡萄糖外，同上条件制备。荧光光谱扫描(激发波长370nm、发射波长440nm、狭缝3nm) 鉴定AGEsBSA。

　　1.2.2  HRMC的培养 

　　加入DMEM培养液(含10mmol・L-1 Hepes、0.37% NaHCO3、100U・L - 1青霉素、100U・L - 1链霉素及10%灭活小牛血清)，置于37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中，每天换液1次，3～4d传代1次。

　　1.2.3  分组实验 

　　当细胞达到一定数量后将处于对数生长期的HRMC按1×104 移入6孔板中，于37℃、5%CO2的培养箱中孵育至细胞次全融合，弃上清，每孔加入2.0ml不含小牛血清的DMEM培养液，孵育24h，使细胞同步于G0期，弃上清。然后分别用50、100、200及400mg・L-1 的AGEsBSA 和BSA 干预24h，以DMEM作为空白对照；然后选取敏感浓度200mg・L-1的AGEsBSA 和BSA 分别干预0 、24、48、72h，以DMEM作为空白对照。每组设3个复孔。

　　1.2.4  细胞总RNA的提取 

　　各组至培养终点后，每孔弃培养液以Trizol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的A260nm与A280nm比值在1.60～1.80之间，1%的甲醛变性凝胶电泳证实所提RNA的完整性较好(有28S与18S两条电泳带,其吸光度比值等于2.0)。

　　1.2.5  RTPCR检测半乳糖凝集素3 mRNA的表达 

　　以2μg总 RNA为模板逆转录合成cDNA，用特异性引物对逆转录产物进行半定量PCR。以βactin作为内参引物,在25μl同一体系中进行半乳糖凝集素3和βactin共同扩增。所用βactin的引物：上游5′CGCCGCGCTCGTCGTCGACA3′，下游5′ GTCACGCACGATTTCCCGCT3′，扩增长度619bp；半乳糖凝集素3引物：上游5′CACCTGCACCTGGAGTCTAC3′，下游5′GCACTGGTGAGGTCTATGTC3′，扩增长度497bp。扩增条件:94℃预变性3min；然后94℃变性45s，61℃退火60s，72℃延伸60s，共26个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物于1.5%琼脂糖电泳80V 60min，用GelDocIt imaging system扫描分析仪扫描凝胶图谱，用Smartview分析软件对RNA条带进行密度扫描分析，得出目的条带与内参照条带的吸光度比值，比较各组半乳糖凝集素3 mRNA表达情况。

　　1.3  统计学处理

　　数据以±s表示，SPSS 11.5统计软件分析数据，采用oneway ANOVA进行显著性检验，差异显著性设定为P＜0.05。

　　2  结果

　　2.1  不同浓度AGEs干预HRMC后半乳糖凝集素3基因表达情况

　　培养的HRMC在未加干预时有少量的半乳糖凝集素3表达(图1及图2的1)， 其与βactin的吸光度比值为0.217±0.014；50、100、200及400mg・ L-1 BSA干预后(图1的2、4、6、8) 半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.342±0.013、0.373±0.017、0.347±0.013及0.370±0.031，与DMEM组相比表达增加（P＜0.01），但表达量不随BSA浓度的增加而增加（P>0.05）；50、100、200及400mg・L-1AGEsBSA干预后(图1的3、5、7、9) 半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.643±0.040、0.777±0.031、0.975±0.047及1.170±0.064，与相应浓度的BSA组以及DMEM组相比半乳糖凝集素3的表达显著增加（P＜0.001），且随着AGEs浓度的增加而增高（P＜0.05）。

　　M.分子质量标记；1～9泳道依次表示DMEM组、50mg・L-1BSA组、50mg・ L-1AGEsBSA组、100mg・ L-1BSA组、100mg・ L-1AGEsBSA组、200mg・ L-1BSA组、200mg・ L-1AGEsBSA组、400mg・ L-1BSA组、400mg・ L-1AGEsBSA组。#与DMEM组相比，P＜0.05;*与DMEM及BSA组相比，P＜0.05

　　图1  不同浓度的AGEs对半乳糖凝集素3表达的影响（略）
　　Fig 1  The mRNA expression of galectin3 andβactin in HRMC incubated with different
concentrations of AGEsBSA for 24h

　　2.2  200mg・L-1 AGEsBSA干预HRMC不同时间半乳糖凝集素3基因表达情况

　　DMEM组细胞培养0 、24、48、72h(图2的1、2、5、8)，半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.457±0.021、0.480±0.025、0.499±0.034、0.449±0.033，不同时间相比没有差异（P>0.05）；BSA干预组细胞培养0、24、48、72h(图2的1、3、6、9)，半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值依次为0.457±0.021、0.592±0.031、0.634±0.026、0.601±0.031，不同时间相比没有差异（P>0.05），但与培养相同时间的DMEM组细胞相比，半乳糖凝集素3的表达增加（P＜0.05）；AGEsBSA组细胞培养0、24、48、72h(图1的1、4、7、10)，半乳糖凝集素3与βactin的吸光度比值分别为0.457±0.021、0.748±0.066、0.945±0.034、1.200±0.052，随着培养时间的延长，半乳糖凝集素3的表达逐步增加（P＜0.01），且比相应时间的BSA组及DMEM组表达均高（P＜0.05）。

　　M.分子质量标记；1～10泳道依次表示DMEM干预0h 、DMEM干预24h、200mg・ L-1BSA干预24h、200mg・ L-1
AGEsBSA干预24h、DMEM干预48h、200mg・ L-1BSA干预48h、200mg・ L-1AGEsBSA干预48h、DMEM干预72h、200mg・ L-1BSA干预72h、200mg・ L-1AGEsBSA干预72h。#与DEME组相比，P＜0.05;*与DMEM及BSA组相比，P＜0.05

　　图2  不同干预时间的AGEs对半乳糖凝集素3表达的影响（略）
　　Fig 2  The mRNA expression of galectin3 and βactin in HRMC incubated with AGEsBSA
（200 mg・L-1） for different time

　　3  讨论

　　DN是糖尿病的严重并发症，其发病机制非常复杂，目前尚未明确。大量资料证明，长期慢性高血糖与DN的发生有关，虽然高血糖导致DN的机制并不完全清楚，但蛋白质非酶糖基化形成的产物AGEs 与其受体的相互作用在DN的发生过程中起关键作用。

　　半乳糖凝集素3是半乳糖凝集素家族的一员，它可以通过碳水化合物结合域与细胞表面及基质糖蛋白的β半乳糖苷残基相互作用，并可以通过N段区域形成肽肽结合。这些结构特性使半乳糖凝集素3具有调节细胞粘附、调控细胞周期、mRNA剪切功能、与晚期糖基化终产物高亲和力结合等多种功能。已有研究表明，半乳糖凝集素3在糖尿病的慢性并发症的靶组织中均有表达［58］，它可能参与了糖尿病慢性并发症的发生发展。本研究通过观察AGEs对HRMC 半乳糖凝集素3表达的影响，为进一步探索半乳糖凝集素3在DN中的作用奠定基础。

　　本实验发现, 随AGEBSA 干预(24h) 浓度从50、100、200 到400mg・ L-1不断增加,HRMC半乳糖凝集素3的表达相应增加；选取敏感浓度200mg・ L-1 AGEBSA进一步实验,发现随干预时间从0、24、48h 到72h， 半乳糖凝集素3的表达水平逐步升高,证实AGEBSA 能呈浓度和时间依赖方式使HRMC半乳糖凝集素3表达增加。BSA组与DMEM组相比，半乳糖凝集素3的表达轻度升高，可能由于半乳糖凝集素3可以调节细胞粘附，BSA通过细胞与蛋白的相互作用使半乳糖凝集素3的表达升高。

　　半乳糖凝集素3能与AGEs高亲和力结合，并参与AGEs的内化和降解。AGEs干预HRMC后，半乳糖凝集素3表达增高。这种改变可能是代偿性的增高［9］，使细胞清除AGEs的能力增加。从这个意义上讲，半乳糖凝集素3可以通过增加AGEs的清除，而在DN的发生中起到保护性的作用，这与Pugliese 等［10］实验结果一致。Pugliese 等发现敲除半乳糖凝集素3基因的小鼠与野生型糖尿病小鼠相比，两者代谢紊乱的程度相似，但前者的肾脏和肾小球中有更明显的AGEs的积聚，表明半乳糖凝集素3的缺陷损害了对慢性高血糖形成的大量AGEs的清除，由此认为半乳糖凝集素3可能对AGEs介导的组织损伤起了保护性的作用。其机制可能为：（1）半乳糖凝集素3可以上调参与AGEs清除受体（巨噬细胞清道夫受体A和AGER1）的表达，下调介导细胞激活受体（RAGE和AGER2）的表达，从而起到保护性的作用；（2）通过目前还未知的不同于MAPK激活和氧化应激诱导的细胞内途径干扰RAGE和（或）AGE的信号转导，并可能介导AGEs的内化和降解。

　　然而，Pugliese 等［9］早期研究发现，AGEs在上调半乳糖凝集素3表达的同时，也可轻度升高p90的表达，推测半乳糖凝集素3通过与p90相互作用［3］，使p90表达升高而激活细胞。
另外，半乳糖凝集素3除作为AGEs受体外，尚可通过调节细胞与基质的粘附、刺激细胞生长和增殖、巨噬细胞激活以及产生抗凋亡的效应，参与异常组织重构、细胞对细胞外基质粘附的改变以及组织中基质成分的积聚，促使DN的发生发展［9］。

　　综上所述，本研究发现，AGEs可以使体外培养的HRMC 半乳糖凝集素3表达增高，但由于它是一种在细胞内外均可以发挥作用的多功能的凝集素，它参与DN的确切机制还有待于进一步研究，对其深入研究有可能发现预防和糖尿病慢性并发症的新途径［11］。

　　［］

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