硒和镁拮抗二氧化硅致肺泡巨噬细胞氧化损伤的研究

                  作者：谈伟君,季晖,何整,陈国银

［摘要］目的:观察亚硒酸钠与硫酸镁单独及联合应用对染尘肺泡巨噬细胞丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）及过氧化氢酶（CAT）水平变化的影响，寻找二者的最佳剂量组合。方法:采用大鼠肺灌洗法纯化获得肺泡巨噬细胞（1×109 L-1），同时加入SiO2及不同浓度的亚硒酸钠溶液、硫酸镁溶液、亚硒酸钠+硫酸镁溶液，于37℃、5%CO2培养条件下培养18 h后，检测MDA、H2O2含量及CAT活性。结果:亚硒酸钠与硫酸镁单独以及两者联合应用都可以使SiO2染毒的肺泡巨噬细胞MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高,且以10μmol・L-1亚硒酸钠与10μmol・L-1硫酸镁联合作用效果最好。结论:亚硒酸钠与硫酸镁在体外可有效拮抗SiO2粉尘的细胞毒性作用，二者合用效果更佳。

　　［关键词］二氧化硅;亚硒酸钠;硫酸镁;肺泡巨噬细胞;氧化损伤;大鼠

　　硒与镁是人体必需的元素，具有许多极为重要的生理生化作用,参与机体多种酶的构成，在体内抗氧化过程中发挥重要作用。已有研究证明，硒在体外有一定拮抗粉尘细胞毒性的作用［12］。硫酸镁在拮抗SiO2细胞毒性的作用与及硒、镁两种物质联合应用的研究尚未见报道。本研究主要探讨硒、镁两种元素单独及联合应用对染尘巨噬细胞丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）含量及过氧化氢酶（CAT）活性的影响，以期为矿物元素应用于矽肺的防治提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　11  材料

　　111  实验动物  健康雄性Wistar大鼠，体质量180～220g,由本校实验动物中心提供。

　　112  石英粉尘  采用标准的SiO2粉尘，由预防医学院提供，游离SiO2的含量大于97％，粒径小于5μm的占95％以上，临用前新鲜研磨后用生理盐水配成10g・L-1的悬液待用。

　　113  RPMI 1640培养液  日本产RPMI 1640培养基干粉，每袋104g，溶于1 000ml去离子水，抽滤除菌并分装，4℃冰箱保存备用。内含2mmol・L-1的L谷氨酰胺、100U・ml-1青霉素、100μg・ml-1链霉素。临用前加入10%小牛血清。

　　114  亚硒酸钠（Na2SeO3）  由上海金山县兴塔化工厂生产，分析纯，批号：940802，临用前用生理盐水配成1.0mmol・ml-1的溶液待用。

　　115  硫酸镁（MgSO4）  由上海试四赫维化工有限公司生产，分析纯，批号：041107，临用前用生理盐水配成05mmol・ml-1的溶液待用。

　　116  MDA、H2O2、CAT试剂盒  由南京建成生物工程研究所提供。

　　12  方法

　　121  肺泡巨噬细胞（AM）的获取与培养  大鼠股动脉放血处死，在无菌条件下进行肺灌洗，收集灌洗液，细胞纯化后调整浓度为1×109 L-1。按实验设计分成：（1）阴性对照组（生理盐水）。（2）SiO2组，含SiO2200μg・ml-1。（3）Na2SeO3组，内含SiO2200μg・ml-1外，Na2SeO3设05、10、20μmol・L-1 3个浓度。（4）MgSO4组，内含SiO2200μg・ml-1外，MgSO4设05、10、20μmol・L-1 3个浓度。 （5）Na2SeO3与MgSO4联合应用组，内含SiO2200μg・ml-1外，Na2SeO3与MgSO4各按上述3种剂量采用正交表L9(34)的设计，共9个剂量组。均于37℃、5%CO2培养箱培养18 h后检测各指标。

　　122  检测指标  MDA、H2O2、CAT均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，操作方法严格按照说明书进行。

　　13  统计学处理实验数据应用SAS82软件进行完全随机设计资料方差分析及正交实验设计方差分析。

　　2  结果

　　21  Na2SeO3单独作用对染尘AM MDA、H2O2和CAT水平的影响    SiO2粉尘组AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，与阴性对照组比较，具有统计学意义(P< 005)。不同剂量Na2SeO3单独作用后MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，其中以加入的20μmol・L-1 Na2SeO3组的效果最明显。见表1。

　　表1  Na2SeO3单独作用18 h后染尘AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的变化（略）

　　注：A组为200mg・L-1 SiO2;B组为200mg・L-1 SiO2+05μmol・L-1 Na2SeO3;C组为200mg・L-1 SiO2+10μmol・L-1 Na2SeO3;D组为200mg・L-1 SiO2+20μmol・L-1 Na2SeO3

　　1)与A组比较，P<005; 2)与阴性对照组比较，P<005

　　22  MgSO4单独作用对染尘AM MDA、H2O2和CAT水平的影响SiO2粉尘组AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，与阴性对照组比较，具有统计学意义(P<005)。不同剂量MgSO4单独作用后MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，其中以加入的20μmol・L-1 MgSO4的效果最明显。见表2。

　　表2  MgSO4单独作用18 h后染尘AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的变化（略）

　　注：A组为200mg・L-1 SiO2;B组为200mg・L-1 SiO2+ 05μmol・L-1 MgSO4;C组为200mg・L-1 SiO2+ 10μmol・L-1 MgSO4;D组为200mg・L-1 SiO2+ 20μmol・L-1 MgSO4。A组为200mg・L-1 SiO2;B组为200mg・L-1 SiO2+05μmol・L-1 Na2SeO3;C组为200mg・L-1 SiO2+10μmol・L-1 Na2SeO3;D组为200mg・L-1 SiO2+20μmol・L-1 Na2SeO3

　　1)与A组比较，P<005; 2)与阴性对照组比较，P<005

　　23  Na2SeO3与MgSO4联合作用对染尘AM MDA、H2O2和CAT水平的影响SiO2组AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，与阴性对照组比较，具有统计学意义(P <005)。不同剂量Na2SeO3与MgSO4组合后，MDA及H2O2含量均下降，CAT活性有所增高，经正交试验设计方差分析，在染尘同时加入10μmol・L-1 Na2SeO3与10μmol・L-1MgSO4联合应用效果最好。Na2SeO3与MgSO4的交互作用也具有统计学意义。见表3。

　　表3  Na2SeO3与MgSO4联合作用18 h后染尘AM中MDA、H2O2、CAT的变化（略）

　　1)与200mg・L-1 SiO2组比较，P<005; 2)与阴性对照组比较，P<005

　　3  讨论

　　SiO2致肺泡AM损伤是矽肺发病的重要环节之一，SiO2粉尘进入机体后可引发肺泡巨噬细胞的自由基和脂质过氧化自由基反应。硒、镁是人体必需的元素， 参与机体多种酶的组成，涉及生物体内的细胞代谢，具有重要的生理功能。研究证实，硒、镁和矽肺之间有密切相关的联系［34］。MDA作为脂质过氧化作用的主要产物之一，可通过共价烷化赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸对蛋白质加以修饰，引起蛋白变性［5］。MDA可以与蛋白质游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联［6］。Hartley等［7］用四氯化碳、铁/抗坏血酸诱发肝细胞脂质过氧化，采用兔多克隆抗体测定MDA加合物，发现了13种丙二醛修饰蛋白。MDA 与蛋白结合后可导致蛋白对酶解作用的敏感性下降［8］。过多的H2O2和超氧化物反应可形成活性更强的・OH，后者参与脂质氧化的链式反应，还可直接结合到DNA上形成羟化反应；H2O2可被髓过氧化物酶代谢，产生的衍生物次卤酸，也有很强的活性［5］。自由基的清除依赖于非酶类抗氧化剂和酶类抗氧化剂。CAT是重要的酶类抗氧化剂，广泛分布于各种组织细胞中，在H2O2浓度较高时，可催化H2O2转变成H2O与O2。硒与硒的化合物在消除自由基、抗脂质过氧化方面发挥重要作用，可清除脂质过氧化自由基中间产物，分解脂质氢过氧化物，修复自由基引起的硫化物的分子损伤，在自由基破坏生命物质前将其清除或转变为稳定化合物，还能催化巯基化合物作为保护剂的反应。有研究表明，镁可减少缺血后再灌注心肌乳酸脱氢酶的漏出, 维持谷胱甘肽过氧化物酶的活性,降低心肌组织中的丙二醛含量，从而减少氧自由基的产生，起到抗脂质过氧化而保护心肌细胞的作用［911］,Mg 2+对内皮细胞及培养乳鼠心肌细胞羟自由基诱导的脂质损伤有保护作用［1213］,镁还作为钙的拮抗剂减少自由基的生成，减轻膜脂质过氧化反应［14］。

　　［］

　　［1］焦石,谈伟君,周敏锌和硒拮抗二氧化硅细胞毒性作用的研究［J］. 卫生和职业病，2005,31(4): 200202

　　［2］刘艺敏,张敬,罗晓阳,等硒对染尘肺泡巨噬细胞脂质过氧化和抗氧化酶影响的实验研究［J］. 公共卫生，2001,17(5): 414415

　　［3］龚建新,孙晓武,石南宁,等矽肺高危人群二种资料早期并且判别的比较［J］. 中国工业医学杂志，1999, 12(6): 338340

　　［4］刘安生,施晓红,刘大智,等测定发中微量元素筛选0+期接尘工人的研究［J］. 预防医学情报杂志，1999, 15(1):35

　　［5］夏世均 吴中亮分子毒基础［M］. 武汉： 湖北技术出版社,2001：8490

　　［6］HIPKISS A R,PRESTON J E,HIMSWOTH D T,et alProtective effects of carnosine against malondialdehyde induced toxicity towards cultured rat brain endothelial cells［J］. Neuro Sci Lett,1997,238:135138

　　［7］HARTLEY D P,KROLL D J,PETERSEN D RProoxidantinitiated lipid peroxidation in isolated rat hepatocytes:detection of 4hydroxynonenal and malondialdehydeprotein adducts［J］. Chem Res Toxical,1997,10(8):895905

　　［8］BURCHAM P C, KUHAN Y TDiminished susceptibility to proteolysis after protein modification by the lipid peroxidation product malondialdehyde:inhibitory role for crosslinked and noncrosslinked adducted proteins［J］. Arch Biochem Biophys,1997,340:331337

　　［9］齐志敏,王倩,张英杰,等大鼠心脏缺血再灌损伤与葡萄糖酸镁的保护作用［J］. 中国临床康复， 2005, 9(27):5153

　　［10］时安云,徐海镁对缺血后在灌注心肌的保护作用［J］. 中国病理生理杂志，1996,12(2):126129

　　［11］刘华章,詹澄扬镁对却血后再灌注心肌脂质过氧化物的影响［J］.  广州药学院学报， 1998,14(1)：1819

　　［12］吕晓华,王瑞淑镁对内皮细胞脂质过氧化和抗氧化酶的影响［J］. 营养学报，2001,23（3）:250253

　　［13］李洁,徐标,何家声镁离子对培养乳鼠心肌细胞羟自由基损伤的保护作用［J］. 铁道医学， 1999,27 (6):373375.

　　［14］吴俭,金国强,赵玲缺氧缺血新生大鼠脑组织SOD、MDA和NO的变化及硫酸镁的保护作用［J］.江西医学院学报， 2002,42(1):4951