特异性环氧化酶
［关键词］环氧化酶2抑制剂；狼疮性肾炎；转化生长因子β1；小鼠
狼疮性肾炎(lupus nephritis, LN)是系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)最常见的并发症，肾脏损害的程度是影响SLE预后的重要因素。SLE的发病与多种因素有关，近年有研究报道认为环氧化酶2(COX2)也是重要的炎症性介质，炎症部位的前列腺素（prostaglandin, PG）的合成增多是COX2过度表达的结果，PG也是重要的炎症性介质，增多的PG本身又激起更多的炎症细胞聚积，加重局部的炎症反应，形成恶性循环。随着糖皮质激素、环磷酰胺、霉酚酸酯等免疫抑制剂在LN中的运用，LN治疗取得了长足的进步，但仍有部分患者治疗无效，而且易发生感染、肝肾毒性、骨髓抑制、肿瘤等，再加上停用后疾病易复发在很大程度上限制了其广泛应用［1］，促使人们寻求更为有效的办法来解决免疫抑制剂所带来的诸多问题。我们观察了MRL/lpr小鼠肾组织COX2的表达及选择性COX2抑制剂rofecoxib对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的治疗作用。
1 材料与方法
11 动物分组及治疗MRL/lpr小鼠（12只，3月龄）购自院上海实验动物中心，体质量20～30g。将小鼠随机分成两组:（1）无药物干预对照组，6只，予同体积的05%羧甲基纤维素水灌胃12周；（2）rofecoxib组，6只,予含 rofecoxib (10mg・kg-1・d-1) 的05%羧甲基纤维素水灌胃12周。
12 尿蛋白、血清肌酐、抗dsDNA抗体结合率的测定采用代谢笼准确测量动物24h尿量，用考马斯亮蓝法测定尿蛋白排泄量。尿蛋白总量＞3mg・(24h)-1为蛋白尿。实验开始和结束时于各小鼠眶后静脉丛采血，采用Jaffe法测血清肌酐水平，放射免疫法测定血清抗dsDNA抗体结合率（试剂盒由中国原子能研究院提供）。
13 血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、6酮前列腺素F1α（6KetF1α）、血栓烷B2（TXB2）的测定 实验结束时采用放射免疫法测定AngⅡ、尿6KetF1α、尿TXB2浓度（试剂盒由解放军总科技开发中心放免所提供）。
14 肾组织常规病理分析处死动物后取肾组织，2%的福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、制备3μm切片，经PAS、HE染色，行光镜检查，半定量［2］判断LN肾组织活动性指数（AI）及慢性化指数（CI）。
15 肾组织COX2、TGFβ1蛋白检测兔抗鼠COX2、TGFβ1（博士德公司产品）为一抗，以PBS缓冲液替代一抗为阴性对照。二抗采用生物素标记的羊抗兔多克隆IgG，检测对照组、rofecoxib组肾组织COX2、TGFβ1蛋白的表达，切片经DAB显色。
16 机图像分析应用北航医学病理图像定量分析系统，通过光学显微镜放大400倍摄取图像，输入图像分析系统内。PAS片400倍下随机测定5~10个肾小球系膜基质，其增生程度以肾小球细胞外基质（ECM）面积与肾小球面积的比值表示。高倍镜（400倍）下随机对选取视野内TGFβ1免疫组化阳性信号进行图像分析，计算对照组和各治疗组肾组织TGFβ1平均阳性表达率。每张切片随机选取10个肾小球，结果以肾小球中COX2阳性目标总面积/统计场总面积（面密度值）表示。
17 统计学处理数据以±s表示，两组计量资料比较采用t检验；尿TXB2与尿蛋白之间的关系采用直线相关分析。以上均由SAS软件完成。
2 结果
21 抗dsDNA抗体结合率、24h尿蛋白定量、血肌酐的测定 实验开始时两组尿蛋白排泄量、血肌酐水平、抗dsDNA抗体结合率差异无显著性（P＞005）。实验结束后， rofecoxib组尿蛋白排泄量明显减少、血肌酐水平稳定, 与对照组比较差异有显著性（P＜005）；抗dsDNA抗体结合率两组比较差异无显著性（P＞005）。见表1。
表1 两组24h尿蛋白、血肌酐和抗dsDNA抗体结合率的比较（略）
与对照组比较，1)P<0.05， 2)P<0.01
22 血AngⅡ、尿6KetF1α及尿TXB2的测定实验结束后，rofecoxib组血 AngⅡ及尿TXB2分别为(7781±3026) pg・ml-1和(99225±12045)pg・ml-1，对照组血 AngⅡ及尿TXB2与分别为(1424±6070) pg・ml-1和(182980±77757) pg・ml-1，两组比较差异有显著性（均P＜001)；对照组尿6ketF1α为(15502±76815) pg・ml-1,rofecoxib组(13611±87428) pg・ml-1，两组比较差异无显著性（P＞005）。
23 肾组织病检查实验结束后，小鼠肾小球ECM面积与肾小球面积的比值rofecoxib组为0132±005, 对照组为0077±0096，两组比较差异有显著性（P＜005）。
24 MRL/lpr小鼠肾组织COX2、TGFβ1蛋白检测 免疫组化半定量分析结果示，rofecoxib组TGFβ1阳性表达率（332±079）%，对照组TGFβ1阳性表达率（588±096）%，两组比较差异有显著性（P＜001）。小鼠肾组织COX2平均面密度值rofecoxib组为028±009，对照组为033±006，两组比较差异有显著性（P＜005）。
25 MRL/lpr小鼠尿TXB2与尿蛋白之间的关系MRL/lpr小鼠尿TXB2与尿蛋白之间呈显著正相关，相关系数r=0553 99，回归方程为y=0000 6 x+3925 5，决定系数R2=0306 9（F=805,P=00064）。
3 讨论
肾脏PG的合成非常活跃，PG在多方面调节肾脏的生理功能，诸如肾脏血流动力学、肾素分泌和肾小管钠水重吸收。环氧化酶（COX）是PG合成的限速酶。已知COX有两个同功酶：COX1催化生成的PG主要调节正常组织细胞的生理功能，维持自身代谢的稳定；COX2在生理条件下低表达，COX2的表达增加介导花生四烯酸代谢异常，在肾脏组织的炎症损伤中起着重要的作用［2］。活动期SLE患者外周血单个核细胞中COX2mRNA的表达水平增加［3］。COX2催化生成的PG在致密斑介导肾素的释放中起重要作用，肾素血管紧张素系统（RAS）参与肾脏损害的进展，在肾小球硬化和肾小管间质纤维化等肾脏结构重塑过程中起十分重要的作用。AngⅡ作为一种血管活性物质可引起肾脏血流动力学异常，它可直接促使肾小球系膜细胞增生和肥大，并刺激血管活性物质和细胞因子产生。Ang Ⅱ促生长因子的作用是通过TGFβ1的介导来完成的［4］，Ang Ⅱ可上调TGFβ1在成纤维细胞的表达，促使无活性的TGFβ1结合肽段转化为活性形式，这是TGFβ1发挥作用极为关键的限速步骤。TGFβ1通过自分泌和旁分泌方式作用于成纤维细胞和单核细胞/巨噬细胞，促进其细胞外基质及细胞因子的表达，导致细胞外基质进行性积聚，促进炎症细胞在肾小球和肾小管间质浸润，从而促进纤维化进程。这种作用归因于Ang Ⅱ直接增加肾小球毛细血管压力，而且参与细胞因子如TGFβ1的调节和表达［5］，血管紧张素转化酶抑制剂或Ang Ⅱ受体拮抗剂可降低大鼠梗阻性肾病模型的TGFβ1和IV型胶原mRNA水平［6］。TGFβ1已被公认为是导致细胞外基质积聚的重要生长因子，且和组织硬化密切相关［7］。本研究显示，选择性COX2抑制剂能减少肾组织TGFβ1的表达，抑制细胞外基质的产生，肾损害减轻。推测与选择性COX2抑制剂降低促使肾素释放的PG水平，减少了肾素水平有关。COX2参与了LN的发生与，应用rofecoxib后，其缩血管前列腺素TXA2的代谢产物TXB2明显减少，而扩血管前列腺素PGI2的代谢产物6KetF1α没有变化，提示选择性COX2抑制剂只拮抗COX2诱导的缩血管PG的产生,并不影响扩血管PG的功能。选择性COX2抑制剂减轻蛋白尿并延缓进行性肾损害，其作用机制可能是COX2受抑制，使促进肾素释放的PG产生减少，从而部分抑制了RAS系统，血管紧张素II水平降低，抑制MRL/lpr自发狼疮小鼠肾组织内TGFβ1的表达，从而减少了肾小球内细胞外基质的沉积，延缓肾小球硬化的发生与发展；选择性COX2抑制剂能抑制COX2的活性，减少其代谢产物TXA2的产生，使肾组织活动性指数降低，减少尿蛋白、稳定肾功能。
［］
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