禽流感病毒检测技术研究进展

　　禽流行性感冒病毒简称禽流感病毒(AIV)，属于正粘病毒科、流感病毒属。流感病毒根据可溶性抗原不同可分为A、B、C ３型，只有 A 型(AIV)易变异［1］，并可在禽、人、猪、马和海洋哺乳动物中暴发流行，出现轻度呼吸疾病到严重败血症等。1878 年 AIV 在意大利首次暴发，其后在英、法、德等欧洲国家和美国均有流行。高致病性 AIV H5N1 于 1997 年在香港致 6 人死亡，2003～2004 年在亚洲致 4 人死亡，2003 年 H7N7 在荷兰致 １ 人死亡［2］。AIV 给人类健康已带来严重威胁，引起全球的极大关注，AIV 检测技术也随之成为人们研究的热点。现就近年来 AIV检测技术研究进展作一综述。

　　1  病原学检测

　　鸡胚分离培养是检测病禽组织中AIV的一种经典、准确、敏感的病原学诊断方法，可以作为金标准，特异性和敏感度均可以达到100%［2］。

　　2  血清学检测

　　21  病毒中和试验（NT） 作为经典方法，病毒中和实验操作繁琐、耗时、费料，临床几乎不用。

　　22  血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验AIV 能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。血凝和血凝抑制试验可以鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制试验来确定HA亚型。

　　23  神经氨酸酶抑制（NI）试验微量神经氨酸酶（NA）抑制剂抑制NA的活性，并以半抑制浓度IC50鉴定NA亚型。Hurt等［3］用5mg的抗病毒药物zanamivir建立的荧光NI试验，检测阳性样本H1N1、H1N2，符合率分别为N1 955%，N2 897%，平均935%（187/200）。该方法成本低，适于大规模地应用。

　　24  琼脂凝胶扩散试验（AGP） 用于检测AIV共同抗原核蛋白或基质蛋白。由于所有的AIV 都具有型特异性共同抗原，用一种AIV的抗原或抗血清就可对所有AIV 的抗体或抗原进行鉴定。免疫双向扩散及免疫电泳中以沉淀线判定可以定性，免疫单辐射扩散试验可以定量。

　　25  免疫荧光技术(IFT) 将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原抗体反应。最早用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞中特异性的抗原、核蛋白(NP)或基质蛋白(MP)抗原。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也可出现部分荧光。

　　26  酶联免疫吸附试验(ELISA) 运用ELISA原理建立的AIV检测方法较多，如用单克隆抗体介导的、经生物素一亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法，为进一步研究检测试剂盒提供基础［4］。AIV抗体胶体金检测试纸条则是胶体金免疫层析分析法，用纯化病毒与胶体金颗粒偶联，吸附在玻璃纤维上制作而成，不需要其他试剂,一步完成,反应时间只需要几分钟(5～10min)，是一种检测微量AIV抗体快速、简便的方法［5］。郑其升等［6］用基因工程重组HA蛋白作为抗原建立了检测AIV 抗体的间接ELISA方法，可以检测H3、H5、H7、H9亚型血清，特异性高，与传统HI方法比较，符合率为 971%（774/807）。基于重组HA蛋白的间接ELISA方法可望用于AIV的保护性抗体水平检测。

　　3  单链构型多态性(SSCP)

　　作为检测基因变异的手段已得到广泛应用，其原理是单个核苷酸的置换引起DNA单链构象改变,在非变性电泳中足以导致泳动率变化。Quinto等［7］用高通量 SSCP 与限制性片段长度多性（RFLP）分析法对照，检测了近50株流感病毒的400多个基因片段，符合率为98%。

　　4  核酸扩增方法

　　41  RTPCR基于MP、NP 基因的高度保守区的引物，RTPCR可以鉴定AIV［810］。Lee等［9］在此基础上针对H1～H15又分别设计了15对HA基因的特异性引物，同时进行15管RTPCR，可以检测H1H15的HA亚型，该法所测80株病毒样品，与血清学方法符合率为100%。但单管单测，操作繁琐。Phipps等［11］建立了相对简便的RTPCR的AIV检测法，仅用一对引物扩增出H1～H15的HA2基因，产物由双脱氧核酸链中止法测序分析，盲测12株标准病毒和30株样品病毒，并与HI对照，完全相符。为提高扩增的灵敏度和特异性，也可采用巢式或半巢式RTPCR［8］。

　　42  多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基础之上实现单管多检的相对快速和的检测方法。 Malik等［12］建立的mRTPCR方法，检测3种不同的鸟类呼吸道病毒，与单管单检RTPCR方法结果完全相符。Yamada等［13］ 建立了包括5对引物的mRTPCR体系，可鉴别5种亚型AIV。BellauPujol等［14］运用多重半巢式RTPCR可以检测包括AIV的12种呼吸道RNA病毒，使检测范围进一步扩展，其203个样本与培养方法及直接免疫荧光法对照，综合敏感度为98%。

　　43  Realtime RTPCR(RRTPCR)运用特异性的荧光水解探针的RRTPCR方法可使检测时间缩短为4 h ［10，15］。Lee等［10］建立的检测H5、H7亚型AIV的RRTPCR方法，与传统的培养方法比较，并以EID50（50%鸡胚致病指数）为评价指标，呈正相关（r  = 0972），T 检验无显著差别（P >021）。其重复性试验呈正相关（r = 0902），灵敏度H5为1 fg或 10２ RNA拷贝，H7为10-1 fg或10 RNA拷贝，所测病毒浓度均低于1010 EID50，该灵敏度高于培养方法。

　　44  依赖核酸序列的扩增（NASBA）NASBA是一种快速、等温的RNA 扩增技术，整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，是以转录为基础，单链核苷酸的连续扩增，其反应产物是单链RNA。扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发光寡核苷酸探针杂交后，形成复合物，经NucliSens阅读器直接检测电化学发光强度［1617］。Collins等［16］检测了亚欧地区H5亚型AIV，同时还鉴别出高致病及低致病H5亚型。Lau 等［17］建立的NASBA技术可以检测H1～H15亚型的AIV，并能区分出H5及H7亚型，整个过程从核酸分离、扩增、检测在6 h 以内，灵敏度与鸡胚培养相当。

　　45  环介导的等温扩增（loopmediated isothermal amplification, LAMP）    Poon等［18］介绍了一种新的更加简便的扩增方法，即环介导的等温扩增,特异性地针对6个独立的结合位点设计两对引物扩增，以看家基因或外源性RNA分子作为阳性对照。由于反应中产生大量焦磷酸镁，可以肉眼判断结果，无需凝胶电泳。作者用该方法检测了SARS病毒后，又检测了H1～H3的AIV，与常规方法比较符合率为100%。

　　5  基因芯片

　　将RTPCR获得的cDNA固化于芯片，利用核酸探针技术构建的检测流感病毒A、B及其亚型的芯片平台， Cy3、Cy5标记的核酸探针与靶DNA杂交，可以进一步鉴别混合体系中扩增产物。Li等［19］用cDNA芯片及mRTPCR对流感病毒进行检测及分型，结果显示cDNA芯片为基于PCR的诊断技术提供了补充，因为基于PCR的方法，直接从DNA扩增片段大小不足以证明是目的产物。王秀荣等［20］依据M蛋白进行基因型别鉴定和HA基因亚型鉴定，用Cy5荧光标记，在基因芯片平台上构建检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的实验技术模型，检测AIV的cDNA，杂交达到预期结果。Kessler等［21］考虑到三维芯片潜在的优势（因其增加了几何面积，使反应效率提高，同时动态的流质也使杂交时间缩短），将芯片技术进一步改进，建立了检测流感病毒A、B的三维芯片平台，通过比较实验，选择了特异性强的随机 RTPCR 扩增方法，和低背景的化学发光检测方法，检测了AIV （H1N1、H1N2、H3N2、H5N1）和流感病毒B，特异性好，全部检测过程不超过5 h。

　　6  展望

　　病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测 AIV方法的对照，但病毒分离培养耗时长，至少需7 d，不利于快速诊断，病毒分离的实验条件要求较高，同时有高致病性的危险，对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。AIV在鸡胚培养过程中还可能发生发生变异［22］。血凝及血凝抑制试验特异性好，但其操作相对繁琐，同时必须具备一定血凝效价的标准病毒和新鲜制备的红细胞。血清学检查对最后确诊有回顾性诊断价值，一般只能在发病23周甚至更长时间才能有抗体阳性出现［17］。由于 AIV 血清型众多，新的变异株不断出现，制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，且在各种免疫接种的情况下，血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。核酸扩增技术（NAT）检测 AIV，选择好靶基因和引物及优化反应参数，均可获得高灵敏度和特异性［23］。对于血清型众多的 AIV，不同亚型致病性不同，宿主分布不同，故快速、特异地分型在 AIV 诊断中显得尤为重要，而当前的核酸扩增技术尚不能高通量地鉴别出所有 HA 或 NA 的已知亚型。RTPCR 方法能够获得所有 AIV 的已知 HA 亚型，但最终结果尚需借助测序方法［10］，不能作为常规检测手段。要实现高通量、大规模的检测，有望借助生物芯片这项技术。生物芯片正逐步应用于细菌及病毒的检测，它不仅能克服 PCR 扩增技术中难题，对 PCR 扩增技术还能起到补充作用［19］。目前人们针对病毒，甚至 AIV 检测芯片不断优化杂交条件；将核酸扩增产物片段化，以减少核酸二、三级结构效应对杂交的影响；以及对芯片载体结构和检测方法进行改进，都为建立快速、灵敏、特异的 AIV 检测方法提供平台［21］。

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