蚯蚓纤溶酶抑制胃癌细胞株MGC803 增殖及诱导凋亡的作用
【摘要】 目的：研究蚯蚓纤溶酶对人胃癌细胞株MGC803抑制增殖及诱导凋亡的作用，并初步探讨蚯蚓纤溶酶诱导凋亡的作用机制。方法：采用MTT法观察蚯蚓纤溶酶对MGC803细胞增殖的影响，DNA凝胶电泳技术观察凋亡细胞变化，流式细胞术观察细胞凋亡率的变化，免疫细胞化学染色法检测蚯蚓纤溶酶对MGC803细胞p53蛋白表达的影响。结果：蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞增殖有明显抑制作用，呈剂量依赖性。蚯蚓纤溶酶4 uku·ml-1作用于胃癌细胞48h后，DNA琼脂糖凝胶电泳观察到典型梯状条带。蚯蚓纤溶酶浓度分别为2、4、8 uku·ml-1作用于胃癌细胞48h后均可诱导细胞凋亡，各组细胞凋亡率分别为（29.51±5.54）％、（61.63±7.12）％、（80.82±5.40）％，与对照组相比，凋亡率升高有统计学意义（P<0.01）。蚯蚓纤溶酶2、3 uku·ml-1组作用于细胞48 h后，p53蛋白表达减少，平均光强度分别为1.299±0.07、1.203±0.06，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：蚯蚓纤溶酶在体外可以抑制MGC803细胞增殖，其机制可能与蚯蚓纤溶酶抑制p53蛋白表达并诱导细胞凋亡有关。
【关键词】 蚯蚓纤溶酶 人胃癌细胞 细胞凋亡 p53蛋白
蚯蚓纤溶酶是从鲜蚯蚓中提取的活性成分，在体内外对肿瘤细胞均有杀伤作用，但其作用机制一直未能得到充分阐明。研究表明，蚯蚓提取物在体外对多种人癌细胞株有抑制作用[1?3] ，其抑制肿瘤细胞生长的活性成分主要是纤溶酶和纤溶酶原激活酶。李洪燕等[4]用人胃癌BGC823和人乳腺癌B37裸鼠移植瘤模型对蚯蚓纤溶酶进行体内抗肿瘤药效学观察，显示纤溶酶对两种裸鼠移植瘤生长均有抑制作用。本实验在体外研究蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞的抑制作用，并初步探讨其作用机制。
1 材料和方法
1.1 材料
蚯蚓纤溶酶由南京农业大学免疫生化研究所分离提取，胃癌细胞株MGC803由解放军第81全军肿瘤中心传代保存。RPMI 1640培养基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(Sigma公司)，MTT(Amresco公司)，Annexin V?FITC/PI试剂盒(美国BD公司)，鼠抗人p53单克隆抗体、即用型SP免疫组化试剂盒、DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)；酶联免疫检测仪（BIO?RAD550，美国伯乐公司），FACS Vantage SE型流式细胞仪(美国BD公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 MGC803细胞于含10%小牛血清、青霉素100 U·ml-1、链霉素150μg·ml-1的RPMI 1640培养基中，在37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 MTT比色分析 取对数生长期的MGC803细胞，用含10％小牛血清的培养液调整细胞浓度为5×104ml-1，接种于96孔板，每孔200μl。37℃、5% CO2恒温培养24h后更换为无血清的RPMI 1640培养液，继续培养24h，使细胞同步化。分为实验组(再分为蚯蚓纤溶酶1、2、3、4、5、6、7、8 uku·ml-1组)、空白组(不加细胞)和对照组(不加药)，每组设3个复孔，培养48h后每孔加入MTT 20μl（5mg·ml-1），继续培养4h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150μl终止反应，用酶联检测仪于570nm波长处测定每孔光密度(OD值)，细胞生长抑制率，抑制率=[(对照组OD值-空白组OD值)-(实验组OD值-空白组OD值)]/(对照组OD值-空白组OD值)×100％。以上步骤重复3次。
1.2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳 取对数生长期的MGC 803细胞消化传代后，实验组加入终浓度为4uku·ml-1蚯蚓纤溶酶，对照组加入等体积的RPMI 1640细胞培养液，培养48h后，1000r·min-1离心5min。沉淀细胞加入1×STE缓冲液（含10mmol· L-1 Tris?HCl，10mmol·L-1 NaCl，1mmol·L-1 EDTA，pH 8.0）0.6ml，10％SDS 10μl，20mg·ml-1蛋白酶K 10μl，混匀，37℃水浴过夜；次日加入氯仿0.8ml，混匀，37℃水浴过夜；次日再次加入氯仿0.8ml，混匀，室温以8944 r·min-1离心10min，吸取上清，加入无水乙醇1.5ml，混匀，室温以8944r·min-1离心10min，弃上清，倒置EP管，干燥，加水50μl重溶DNA，室温放置30min以上，取6μl DNA，进行2%琼脂糖凝胶电泳，观察梯状条带。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 取对数生长期的MGC803细胞加入终浓度分别为2、4、8uku·ml-1的蚯蚓纤溶酶为实验组，对照组加入等体积的RPMI 1640细胞培养液，培养48h，收集各组细胞，每组细胞3个样本。4℃，1000r·min-1离心10min，弃上清，加入1ml 冷PBS，轻轻振荡使细胞悬浮。4℃，1000r·min-1离心10min，弃上清。重复用冷PBS洗2次，将细胞重悬于200μl结合缓冲液。加入10μl Annexin V?FITC和5μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15min，加入300μl结合缓冲液，在1h内流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.5 免疫细胞化学检测p53蛋白表达 取对数生长期的MGC803细胞，0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为2×105ml-1，接种于内置玻片的6孔板，每孔2ml 细胞悬液，37℃、5%CO2培养48h。分为实验组(药物终浓度分别为2、3uku·ml-1)和对照组(加入等体积RPMI 1640培养液)。药物作用48h后取出玻片，PBS冲洗，4℃丙酮固定10min，干燥后粘于载玻片上。PBS代替一抗作为阴性对照，按SP试剂盒说明染色，DAB显色，中性树胶封片。p53蛋白显色为胞核呈淡黄色到棕黄色。应用Image?Pro?Plus 4.5图像分析软件分析阳性细胞的着色面积和着色强度，每个浓度组的细胞爬片选取10个视野，用平均光强度表示p53蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理
结果以x-±s表示，采用SPSS 13.0软件统计,组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 蚯蚓纤溶酶对胃癌细胞株MGC803增殖的影响
蚯蚓纤溶酶1、2、3、4、5、6、7、8uku·ml-1组作用于MGC803细胞48h后，对MGC803细胞增殖均有抑制作用，而且随着药物浓度的增高抑制率逐渐增高，与对照组相比，抑制率有统计学意义（P<0.01，图1）。药物浓度与抑制率成直线关系，直线回归方程为Y=20.612+10.516X，求得半数抑制率浓度为2.79uku·ml-1。
2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
浓度为4uku·ml-1蚯蚓纤溶酶作用于MGC803细胞48 h后，DNA琼脂糖凝胶电泳可见典型的以180bp为单位的梯状条带，对照组(不加药组)细胞则未见此表现，表明蚯蚓纤溶酶作用于MGC803细胞后，出现凋亡细胞（图2）。
2.3 蚯蚓纤溶酶对MGC803细胞凋亡的影响
蚯蚓纤溶酶2、4、8 uku·ml-1作用于MGC803细胞48 h后，Annexin V/PI双染色后经流式细胞仪进行凋亡细胞计数。结果显示，对照组的凋亡率为（2.01±0.86）%，蚯蚓纤溶酶2、4、8 uku·ml-1作用于细胞后，细胞凋亡率分别为（29.51±5.54）％、（61.63±7.12）％、（80.82±5.40）％，与对照组相比，凋亡率升高有统计学意义（P<0.01）。
2.4 免疫细胞化学检测p53蛋白表达
阴性对照组胞核呈蓝色，未见阳性着色，p53蛋白在未加药对照组细胞中表达较强，阳性表达部位位于细胞核，呈明显棕黄色染色，偶见细胞质染色，平均光强度为2.288±0.41。蚯蚓纤溶酶2、3uku·ml-1作用于MGC803细胞48h后，细胞核染色减弱，呈淡黄色染色，平均光强度分别为1.299±0.07、1.203±0.06，与对照组相比，平均光强度下降，有显著统计学差异（P<0.01），表明p53蛋白较对照组表达减少。
3 讨 论
大量研究表明从蚯蚓中提取的活性成分具有抑制肿瘤生长作用。本研究小组将蚯蚓提取物作用于胰腺癌细胞Eca?109、宫颈癌细胞Hella、红白血病细胞K562后，流式细胞仪检测到凋亡细胞存在，推测其抑癌作用主要是通过将细胞阻滞在G0 G1期，使细胞进入S期减少，以及促进细胞凋亡[4]。本实验通过MTT法观察蚯蚓纤溶酶体外抑制MGC803细胞增殖的作用，实验表明蚯蚓纤溶酶对其有明显的生长抑制作用，随着蚯蚓纤溶酶浓度的增加，抑制率逐渐增加，最高抑制率可达94.5％。细胞凋亡的最后阶段会发生细胞核染色体DNA的降解，实验中将蚯蚓纤溶酶4uku·ml-1作用于MGC803细胞48h后，观察到典型的以180bp为单位的梯状条带，证实了凋亡细胞存在。实验中将蚯蚓纤溶酶作用于MGC803细胞48 h后，流式细胞仪观察到细胞凋亡率随药物浓度的升高而升高，呈剂量依赖性，与MTT结果相一致。我们推测蚯蚓纤溶酶的抑癌作用可能与促进肿瘤细胞凋亡有关。
本实验采用免疫细胞化学染色检测肿瘤细胞中p53蛋白表达，探讨蚯蚓纤溶酶诱导肿瘤细胞凋亡的机制。p53基因与胃癌的关系早已引起人们的关注，p53基因分为野生型和突变型,野生型p53是一种抑癌基因，广泛存在于正常组织细胞中，其生物学功能类似于“分子警察”，监视细胞基因组的完整性，对于无法修复的细胞则通过诱导凋亡而使之清除。研究表明，将野生型p53基因导入胃癌MGC803细胞并表达后,可使G0/G1期细胞增加，抑制细胞进入S期从而抑制细胞增殖[5]。而突变型的p53蛋白不仅丧失了抑癌功能，还具有可以通过和野生型p53蛋白形成寡聚蛋白质复合物,阻碍野生型p53的基因监视功能而导致细胞癌变。Maehara等[6]等发现突变型p53在胃癌组织中常呈高表达，对胃癌发生起着促进作用。由于野生型p53蛋白半衰期极短，不易在细胞内积聚且不稳定，常规免疫组化方法检测到的是突变型p53蛋白。本实验观察到蚯蚓纤溶酶作用于MGC803细胞48h后，与未加药对照组相比，细胞核染色明显减弱，表明p53蛋白表达减少。由此我们推测蚯蚓纤溶酶抗肿瘤的机制可能与抑制突变型p53蛋白表达，从而使野生型p53蛋白解聚发挥其诱导凋亡作用有关。
【】
[1]谢江碧，贺卫国，翁宁，等.蚯蚓中抗肿瘤蛋白组分的提取分离及其抗肿瘤活性[J].生物化学与分子生物学报，2003，19（3）：359?366.
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[3]ENGELMANN P，KISS J，CSONGEI V，et al.Earthworm leukocytes kill HeLa,HEp?2,PC?12 and PA317 cells in vitro[J].J Biochem Biophys Methods，2004，61(1?2):215?227.
[4]何道伟，陈洪，叶银英.蚯蚓提取物体内和体外抗肿瘤作用的研究[J].中国生化药物杂志，2005，26（6）：353?355.
[5]唐大年，朱明炜，刘亚林，等.野生型P53基因诱导人胃腺癌MGC803细胞凋亡的实验研究[J].中华胃肠外科杂志，2001，4（3）：192?194.
[6]MAEHARA Y，TOMODO M，HASUDA S，et a1．Prognostic value of p53 protein expression for patients with gastric cancer?multi?variate analysis [J]．Br J Cancer，1999，79(7?8)：1255?1261.
