香豆雌酚对新生大鼠成骨细胞增殖分化的影响

来源:岁月联盟 作者: 时间:2010-07-12

               作者:韦继南,吴小涛,陈晓刚,王斌

【摘要】  目的:观察香豆雌酚对大鼠成骨细胞(OBs)增殖分化的影响,初步探讨香豆雌酚对OBs的作用机制。方法:用不同浓度香豆雌酚干预OBs,根据不同时间分别用酶消化法测碱性磷酸酶活性和羟脯氨酸含量、放免法测骨钙素含量及半定量RT?PCR法检测OBs内OPG/RANKL基因的表达。 结果:香豆雌酚呈浓度和时间依赖性促进大鼠OBs增殖及碱性磷酸酶表达;干预12h,各浓度组羟脯氨酸含量呈浓度依赖性增高,其中10-8mol·L-1作用最大(P=0.022);培养12h,OBs表达骨钙素呈浓度依赖性,24h达高峰,其中10-8mol·L-1有显著性差异(P=0.012),48h有所下降;不同浓度、时间组香豆雌酚均能促使OBs增加表达OPG mRNA,同时有抑制RANKL mRNA表达的作用,其在24h 10-8mol·L-1浓度作用强度最大(P=0.038),10-5mol·L-1则呈现抑制作用。结论:香豆雌酚能促进OBs的增殖分化,其作用呈浓度和时间依赖性,且至少部分有OPG/RANKL途径的参与。

【关键词】  香豆雌酚;成骨细胞;护骨素;骨质疏松;大鼠

 雌激素在绝经后骨质疏松的发生中起着十分重要的作用,绝经后雌激素替代疗法(hormone replacement therapy,HRT)曾被认为是绝经后骨质疏松的金标准,但随着HRT所带来的阴道出血、乳腺癌、子宫内膜癌等风险大大限制了其临床推广应用[1]。近年来植物雌激素(phytoestrogen,PE)备受关注,它们的结构类似于17β?雌二醇,能预防和治疗绝经后骨质疏松,但对子宫和乳腺无刺激作用[2]。动物实验表明,PE香豆雌酚能减少去卵巢大鼠骨丢失和骨吸收,增加骨密度[3],有研究报道香豆雌酚能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化成熟及骨吸收活性[4],但其具体机制尚不清楚,对成骨细胞的作用也未见报道。为观察香豆雌酚对成骨细胞的直接作用,本实验拟用香豆雌酚干预体外培养的新生大鼠成骨细胞,观察其对成骨指标的影响,初步探讨其对骨代谢的作用及其机制。

  1  材料和方法

  1.1  主要材料新生SD大鼠(东南大学医学院动物实验中心提供),LG?DMEM(Gibco BRL),FBS(杭州四季青),ALP染色试剂盒(南京建成生物研究所),骨钙素试剂盒(北京科美东雅公司),TRIzol(Katara Ltd.),RT?PCR kit(MBI Ltd.),Ⅰ型胶原酶、胰酶、MTT、DMSO、Coumestrol、Estradiol(Sigma Ltd.USA),其余试剂均为国产分析纯。

  1.2  细胞培养

    1.2.1  新生大鼠颅骨成骨细胞培养  参照[5]将新生<24h的SD大鼠放入75%酒精中浸泡5min,无菌取出颅盖骨,清除血管结缔组织,PBS洗涤。将颅盖骨剪成1mm3大小,0.25%胰蛋白酶37℃消化30min,弃去消化液,加入5ml 0.1%Ⅰ型胶原酶消化60min,以200目筛网滤去骨渣,滤液1000 r·min-1离心10min,弃上清,加入含10% FBS的DMEM培养液并调整细胞密度,按1×105ml-1接种细胞于一次性无菌培养瓶中,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。

    1.2.2  成骨细胞鉴定

    1.2.2.1  形态学观察  细胞培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况,药物干预前行台盼蓝染色观察细胞存活率。

    1.2.2.2  碱性磷酸酶染色(改良Kaplow法)  细胞消化后将5mm×5mm大小无菌盖玻片置于培养瓶中,细胞贴壁后取出盖玻片,按试剂盒说明书进行碱性磷酸酶染色。

  1.3  观察指标

    1.3.1  MTT  细胞传代后按2.5×104ml-1接种于96 孔板,2d后改为无血清培养液,24h后分别换为含0 mol·L-1,10-10 ~10-5 mol·L-1香豆雌酚的培养液,并设阳性对照组Estradiol (10-8 mol·L-1),每种浓度重复7孔。在加药后12、24和48h分别取出1块培养板,每孔加入20μl MTT(5 mg·ml-1)37℃继续培养4h,弃培养液,每孔加入200μl DMSO,5min后在酶标仪上490nm波长处测各孔吸光度值,结果用A490 nm表示。

    1.3.2  碱性磷酸酶  细胞接种于6孔板,分组同上,干预12、24和48h后弃培养液,PBS清洗2次,每孔加入1ml 0.1%TritonX?100,反复吹打后1000r·min-1离心3min,酶消化法测上清液中碱性磷酸酶的含量。

    1.3.3  羟脯氨酸  细胞接种于6孔板,分组同上,干预12、24和48h后用酶消化法测上清液中羟脯氨酸的含量(委托南京建成生物研究所检测)。

    1.3.4骨钙素  细胞接种于6孔板,分组同上,干预12和24h后去掉培养上清,PBS清洗2次,加入1ml 0.1%TritonX?100,反复吹打后1000r·min-1离心3min,放免法测上清液中骨钙素的含量。

    1.3.5OPG/RANKL基因表达  细胞接种于6孔板,分组同上,干预12、24和48h后弃上清,PBS清洗3次,TRIzol提抽细胞内总RNA,取2μg总RNA逆转录扩增OPG、RANKL和β?actin基因,引物序列及扩增条件见表1(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。PCR扩增产物于1.5%琼脂糖进行凝胶电泳、EB染色和拍照,并用Image master VDS成像系统行条带光密度分析。表1  各基因引物序列及扩增条件扩增基因

  2  结    果

  2.1  成骨细胞鉴定

    2.1.1  成骨细胞活体观察  倒置相差显微镜下可见成骨细胞呈三角形、多边形和椭圆形等不规则形态,有较多突起,1~3个核仁(图1)。台盼蓝拒染显示活细胞率大于92%。 培养10d的成骨细胞,形态不规则,多呈三角形、多边形、椭圆形等,有较多突起

    2.1.2  碱性磷酸酶染色  光镜下可见绝大部分成骨细胞呈阳性,细胞染色深浅不一,呈棱形、多边形和椭圆形等,形状各异,大小不等,细胞核呈淡绿紫色,细胞浆中充满红棕色碱性磷酸酶阳性颗粒(图2) 。可见染色深浅不一,细胞核呈淡绿紫色,胞浆充满红棕色碱性磷酸酶颗

    2.2  香豆雌酚对成骨细胞增殖和分化的影响

    2.2.1  香豆雌酚对大鼠成骨细胞增殖的影响  MTT结果显示,干预12h各浓度组香豆雌酚能促进成骨细胞增殖,24h作用最强,48h后有所减弱。其中10-9mol·L-1和10-8mol·L-1干预24h时产生显著的促进增殖作用(P=0.02、0.017),但10-5mol·L-1香豆雌酚对成骨细胞增殖产生抑制作用。

    2.2.2  香豆雌酚对大鼠成骨细胞分化的影响

    2.2.2.1  香豆雌酚对大鼠成骨细胞内碱性磷酸酶的影响  培养12、24和48h,各浓度香豆雌酚呈时间和浓度依赖性轻度促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶表达,但无统计学意义。

      2.2.2.2  香豆雌酚对大鼠成骨细胞分泌羟脯氨酸的影响  培养12h,各浓度香豆雌酚呈浓度依赖性促进羟脯氨酸分泌,10-8mol·L-1有显著促进作用(P=0.022);培养24和48h后仅有轻度促进作用,无统计学意义(P=0.10)。

     2.2.2.3  香豆雌酚对大鼠成骨细胞骨钙素的影响  培养12h,各浓度组细胞内骨钙素含量轻度增加,但无统计学意义(P=0.081);培养24h,10-8mol·L-1香豆雌酚显著增加成骨细胞内骨钙素表达,有统计学意义(P=0.012);培养48h,各浓度组细胞内骨钙素含量轻度增加,高浓度(10-5mol·L-1)组出现抑制作用。

     2.2.3  香豆雌酚对大鼠成骨细胞OPG基因表达的影响RT?PCR分析表明,香豆雌酚呈浓度和时间依赖性促进成骨细胞OPG/RANKL基因表达,10-8mol·L-1干预24h显著增加OPGmRNA表达(P=0.015),抑制RANKL基因表达(P=0.038),OPG/RANKL显著升高;高浓度(10-5mol·L-1)香豆雌酚对OPG基因表达有抑制作用(P<0.05)

  3  讨论

  PE分为异黄酮类(isoflavones)、木酚素类(lig?nans)和香豆素类(coumestans)。香豆雌酚是香豆素类的一种,广泛存在于三叶草和卷心菜中。流行病学资料表明,食用富含PE食物的亚洲人,乳腺癌、前列腺癌及骨质疏松症等疾病的发病率较白种人低[6];Dodge等发现香豆雌酚能有效地缓解切除卵巢大鼠的骨质减少,能使大鼠骨质密度恢复到与未切除卵巢大鼠相近的水平[7];在器官培养中,香豆雌酚具有雌激素效能,可增加鸡胚股骨培养中钙含量[8],有人研究发现香豆雌酚类似物KCA?098能促进成骨细胞的分化,提高碱性磷酸酶活性,增加钙磷含量[9],然而,其对成骨细胞作用的机制仍然未明。本实验中MTT结果表明,各浓度香豆雌酚对成骨细胞的增殖在培养12、24和48h都有一定促进作用,其中又以10-8和10-9mol·L-1作用24h时最强,而高浓度(10-5mol·L-1)香豆雌酚反而出现了抑制作用(图3),由此可见高浓度香豆雌酚可能抑制细胞增殖。此外,我们从成骨细胞分化的指标碱性磷酸酶、骨钙素及羟脯氨酸来说明香豆雌酚对成骨细胞分化的影响。碱性磷酸酶、骨钙素分别是成骨细胞早期和晚期分化的指标。本实验中各浓度香豆雌酚干预成骨细胞12、24和48h均轻度增加碱性磷酸酶表达,但无统计学意义(P=0?061);10-8mol·L-1香豆雌酚作用24h能显著增加成骨细胞内骨钙素表达,有统计学意义(P=0.012)。该结果提示香豆雌酚可能影响成骨细胞分化的晚期阶段。羟脯氨酸在Ⅰ型胶原中占有恒定的比例,本实验中我们通过检测羟脯氨酸含量反映Ⅰ型胶原的表达情况。结果表明,各浓度香豆雌酚干预12h,各组培养液上清羟脯氨酸含量呈浓度依赖性增高,10-8mol·L-1显著增高,具有统计学意义(P=0.022);干预24和48h,培养液上清羟脯氨酸含量仅轻度增高,无统计学意义。近年来的分子生物学研究发现,雌激素的作用还与成骨细胞和破骨细胞的分子间对话机制(cross?talk)有关[10]。破骨细胞膜上存在一种跨膜蛋白RANK(receptor activator of nuclear factor ?κβ),而成骨细胞膜上存在一种RANK的配体RANKL (receptor activator of nuclear factor ?κβ ligand),它也是一种跨膜蛋白。雌激素缺乏使得RANKL与RANK结合,就会产生RANKL/RANK/NF?κβ信号级联反应,促使破骨细胞活化[11]。另一方面,成骨细胞还能自分泌一种被称为骨保护素的蛋白质,它作用的靶分子就是自身细胞膜上的RANKL,因此也被称为伪受体(decoy receptor)[12]。雌激素能促进骨髓基质细胞、成骨细胞OPG mRNA的表达,当OPG与RANKL结合后,即阻断RANKL与破骨细胞膜上的RANK结合,从而结束成骨细胞与破骨细胞之间的对话,使破骨细胞内NF?κβ的信号下传中断,抑制破骨细胞的活化和溶骨过程。本实验中RT?PCR分析表明,各浓度香豆雌酚对成骨细胞OPG/RANKL基因表达呈浓度和时间依赖性,10-8mol·L-1干预24h能显著增加成骨细胞OPG基因表达(P=0.015),与对照组17β?Estradiol相当,同时显著抑制RANKL的表达(P=0.038);OPG/RANKL显著升高。低浓度(10-10~10-8mol·L-1)香豆雌酚对RANKL基因表达作用不大。Bord等报道雌激素可有效刺激人成骨细胞OPG/RANKL mRNA和蛋白表达,且呈浓度和时间依赖关系[13]。综上所述,本实验结果初步表明,PE香豆雌酚能促进成骨细胞增殖分化,其作用至少是部分通过OPG/RANKL途径而发挥的。然而,目前对香豆雌酚的研究甚少,对其作用的机理研究尚缺乏充分的实验依据,这也是我们今后努力的方向。

【】
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