心肌肌钙蛋白I异常病人血清结缔组织生长因子表达的研究

                作者：赵桂琴，吴国球，刘乃丰   

【摘要】  目的:检测心肌肌钙蛋白I（cTn I）异常病人血清中结缔组织生长因子（CTGF）水平的变化，探讨CTGF在心肌损伤病人血清中表达的意义。方法:化学发光法检测血清中cTn I水平，并根据cTn I水平分组；利用生物素亲和素EIA分析法检测各组病人血清中CTGF水平。结果:80例病人血清标本按cTn I水平分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3组，CTGF平均水平依次为（13.04±6?85）、（21.67±8.35）及（35.06±24.12）ng·ml－1。其中，Ⅱ、Ⅲ组血清CTGF水平明显高于正常对照组（均P<0.05），Ⅰ组与正常对照组比较差异不显著（P>0.05），Ⅱ、Ⅲ组与Ⅰ组比较差异显著（均P<0.05），Ⅱ组与Ⅲ组比较差异显著（P<0.05）。结论:CTGF在心肌损伤以及心肌梗死后表达上调，可能与心肌纤维化关系密切。

【关键词】  心肌肌钙蛋白I；结缔组织生长因子；心肌损伤；心肌梗死；心肌纤维化

结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是近来发现的一种重要的细胞因子，主要由内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等合成分泌，成年哺乳动物心、脑、肾、肺、肝以及胎盘中均有表达，它与动脉粥样硬化，心、肝、肺、肾等器官的纤维化以及创伤修复密切相关[1?5]。人心肌肌钙蛋白（cardiac troponin，cTn）包括C、T、I 3个亚单位，其中I亚单位（cTn I）在心肌损伤后4～6h释放入血，14～36h达到峰值，是一个十分敏感的特异性心肌损伤标志物，在诊断急性心肌梗死（简称心梗）、判断梗死面积、评价容栓效果等方面具有重要意义。本研究调查不同cTn I水平病人血清中CTGF水平的变化，探索其在心梗后心肌纤维化中的意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验材料CTGF单克隆抗体、多克隆抗体及CTGF标准品（作者所在实验室制备），水溶性生物素(Sulfo?NHS?LC?Biotin)、亲和素(Avidin)和Biotin?HRP(Pierce公司，美国)，化学发光cTn I检测试剂盒(Beckman公司,美国)，高吸附96孔板(Biomat，上海晶美公司),全自动洗板机(Bio?Rad公司，美国)，全自动酶联仪(ALISEI，意大利)，全自动化学发光仪(Access，美国)。80例病人血清标本来自东南大学附属中大临床检验中心，10例正常人血清标本来自东南大学附属中大医院体检中心。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  cTn I的检测及分组所有血清标本采用双盲方式根据cTn I检测试剂盒、全自动化学发光仪操作说明及规程检测cTn I水平。并根据试剂盒诊断标准和ACC/AHA对于心梗的诊断标准，将病人分成排除心肌损伤组（Ⅰ组）、心肌损伤组(未发生心梗，Ⅱ组）及心梗组（Ⅲ组）3组。10例正常人血清标本设为正常对照组。

　　1.2.2  CTGF的检测

　　1.2.2.1  包被  CTGF单抗用0.05mol·L－1 NaHCO3缓冲液（pH 9.6）配制成2μg·ml－1，以100μl·孔－1包被96孔板酶标板，4℃过夜。用含0.5%Tween?80 0.1mol·L－1的PBS(pH 7.4)洗涤3次后加入150μl含2%酪蛋白的0.1mol·L－1 PBS(pH 7.4),37℃孵育2h，洗涤5次后4℃密封保存。

　　1.2.2.2  生物素标记CTGF多克隆抗体  取10mg CTGF多克隆抗体，用1ml0.1mol·L－1 PBS(pH 7.4)溶解，加入16μl(28mg·ml－1)水溶性生物素，混匀，室温放置30min后，将混合物转入透析袋，置于1 L含0.01mol·L－1PBS(pH 7.4)的透析液中，4℃过夜，除去未反应的生物素。

　　1.2.2.3  ABC复合物的制备  取5ml0.1mol·L－1的PBS(pH 7.4)，加入45μl Avidin和45μl Biotin?HRP，混匀，室温反应30min。

　　1.2.2.4  检测  取50μl待测样品及系列稀释的CTGF标准品（0~1 000ng·ml－1）样品加入已包被CTGF单抗的酶标板中，37℃ 1h，洗板6次后加入1∶300 稀释的Biotin?CTGF多抗，37℃孵育1h，洗板6次后各孔加入50μl ABC酶复合物，室温30min后加入显色液A和B各50μl，室温20min，加入50μl 2mol·L－1 H2SO4终止反应，在全自动酶标仪上测定A450值。根据标准曲线标本中CTGF的浓度。1.3  统计学处理结果用x-±s表示，采用单变量SNK法q检验，P<0.05视为有统计学意义。

　　2  结果

　　80例病人血清标本CTGF平均水平为（25.79±19.71）ng·ml－1,Ⅰ组(n=15)、Ⅱ组(n=28)、Ⅲ组(n=37)和正常对照组(n=10)血清CTGF平均水平依次为（13.04±6.85）、（21.67±8.35）、（35.06±24?12）及（14.80±7.13）ng·ml－1，Ⅱ、Ⅲ组明显高于正常对照组（均P<0.05），Ⅰ组与正常对照组比较差异不显著（P>0.05）。Ⅱ、Ⅲ组与Ⅰ组比较差异显著（均P<0.05），Ⅱ组与Ⅲ组比较差异显著（P<0.05），见图1。

　　Ⅱ、Ⅲ组与正常对照组比较，均P<0.05；Ⅰ组与正常对照组比较，P>0.05；Ⅱ、Ⅲ组与Ⅰ组比较，均P<0.05；Ⅱ组与Ⅲ组比较，P<0.05

　　图1  各组cTn I和CTGF水平（略）

　　Fig 1  The levels of cTn I and CTGF in all groups  CTGF levels of group Ⅱ and group Ⅲ significantly increased as compared with control group and group Ⅰ(all P<0?05).GroupⅠhad no significance as compared with control group(P>0.05).There was a statistical significance between groupⅡ and group Ⅲ (P<0?05)

　　3  讨论

　　CTGF是高度保守的CCN多肽家族成员之一，该家族包括CTGF、CYR61、Nov以及最新发现的WISP1/elm1、WISP2/rCop1、WISP3（WISP，Wnt?inducible secreted protein），由349个氨基酸组成，富含半胱氨酸，相对分子质量36 000~38 000，包含4个主要的蛋白结构区：胰岛素样生长因子结合蛋白区、von Willebrand因子C型重复区、血小板反应蛋白（thrombosp?Ondin）1型重复区以及生长因子半胱氨酸群，这些区域都由独立的外显子编码[1]。CTGF可诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质，参与调节细胞增生分化、胚胎发育以及伤口愈合[6?8]。CTGF是促进心肌纤维化的重要细胞因子。CTGF的N端调节肌成纤维细胞分化和胶原合成，C端调节成纤维细胞增殖[9]。本实验心肌损伤组CTGF平均水平明显高于排除心肌损伤组和正常对照组，这与Chen等[10]在有心肌缺血病人心脏标本中检测到的CTGF表达增加一致。心肌损伤作为一种炎症反应，能释放包括CTGF在内的多种炎症细胞因子，而TGF?β、PDGF、FGF、VEGF等细胞因子能刺激CTGF表达上调[11]；同时CTGF参与组织的损伤修复过程，所以在心肌损伤后表达也会增加。心衰致心肌受损，功能下降，又加重心衰，形成恶性循环，肾上腺素、内皮素大量释放可以引起CTGF持续表达增加，同时氧化应激、机械刺激状态的持续存在也能刺激CTGF表达升高。Ahmed等[12]实验显示实验诱导的心衰猪3周后心肌CTGF mRNA水平增加5倍。急性肺栓塞引起心肌损伤造成心肌缺血缺氧，可诱导心脏成纤维细胞CTGF表达增加，预示着CTGF与心肌损伤后的心肌纤维化关系密切。急性心梗是心肌损伤的严重阶段，心梗后坏死的心肌纤维被溶解吸收，纤维肉芽组织形成，梗死区胶原纤维组织增加，同时伴纤维化反应，最终形成纤维疤痕组织。而间质成纤维细胞是正常心肌胶原合成的主要来源，肌成纤维细胞是心梗后心室重构的重要原因。CTGF可以促进心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，离体实验中，CTGF能刺激成纤维细胞增殖。而CTGF能诱导心脏成纤维细胞分泌表达胶原和纤黏蛋白[13]，并能增加心梗部位胶原和纤黏蛋白的表达量[10,14]。  本实验心梗组的CTGF 平均水平明显高于其他组，提示心梗后的心肌纤维化可能与CTGF的表达密切相关。心梗后RAS系统兴奋，AngⅡ可以刺激CTGF的表达，大鼠心脏成纤维细胞用AngⅡ刺激后能经AT1?R途径引起CTGF mRNA和蛋白质表达增加，此作用可以被AT1?R拮抗剂losartan抑制[15]，醛固酮也可以通过MAPK通路和盐皮质激素受体刺激CTGF的表达[16]。Ohnishi等[14]在心梗大鼠的实验研究中发现CTGF在梗死区肉芽组织中的成纤维细胞中高表达，而在其他大鼠的心梗实验中发现左右心室的非缺血区都有CTGF的表达，在心梗后2 d心肌CTGF mRNA水平增加，一直持续到心梗后42 d，这些实验说明CTGF mRNA的诱导高表达从心梗后持续到心梗后较晚的重构阶段。Dean等[17]实验显示在心肌梗死后180 d CTGF mRNA和蛋白仍有大量表达，提示了CTGF与心梗后心肌纤维化密切相关心肌损伤后，无论有无发生心梗，都伴有神经内分泌系统的激活，Kemp等[18]研究显示用100μmol·L－1去氧肾上腺素作用新生兔的心肌1h 或24h，CTGF mRNA最多增加了2.5倍，作用4~24h，CTGF蛋白质最多增加了5倍，在培养的血管平滑肌细胞ET?1通过ETA受体上调CTGF mRNA和蛋白质的表达[19]，因此神经内分泌因素都会增加心肌损伤后CTGF的表达。心肌纤维化是心室重构的重要组成部分[20]，心肌损伤后的心室重构、左心室扩张、心脏功能下降和死亡率的增加相关。本实验心肌损伤组和心梗组CTGF水平明显升高，提示CTGF的表达与心肌损伤后的心肌纤维化相关，心梗组的CTGF平均水平明显高于心肌损伤组，且两组有统计学差异，提示CTGF与心梗后心肌纤维化的关系更为密切。

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