P?gp、MRP、Bcl?2、Bax在膀胱癌中的表达及其意义

【摘要】  目的:探讨P?糖蛋白（P?gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、Bcl?2、Bax在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义。方法：采用SP免疫组化技术检测59例膀胱移行细胞癌和13例正常膀胱组织标本中P?gp、MRP、Bcl?2、Bax的表达。结果：(1)复发膀胱癌组织中P?gp、MRP、Bcl?2表达水平高于初发癌组织(P<0.05)； Bax表达水平与之相反(P<0.05)。（2）P?gp、Bcl?2表达随着病理分级、分期上升而增高，Bax表达随着病理分级、分期上升而下降，MRP与病理分级、分期不相关。（3） P?gp表达与Bcl?2呈正相关，与Bax呈负相关。结论：膀胱癌组织P?gp、MRP、Bcl?2、Bax可作为判断膀胱癌的恶性度及预后的重要指标。

【关键词】  膀胱肿瘤 多药耐药 P?糖蛋白 凋亡

    膀胱癌多为移行细胞癌,在手术基础上辅以膀胱灌注已成为膀胱癌的主要方案。术后易复发是其重要的生物学特征。P?糖蛋白（P?gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）作为两种跨膜蛋白都可以介导肿瘤多药耐药（MDR）。本研究采用免疫组化方法检测P?gp、MRP、Bcl?2、Bax在膀胱癌组织中的表达,并分析P?gp与MRP、Bcl?2、Bax的关系。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    膀胱肿瘤标本59例,来自于本院和江苏省肿瘤2004年12月 2006年7月行电切或开放手术患者（年龄36 83岁,男49例,女10例），均经病证实为膀胱移行细胞癌（TCC）,另取正常膀胱组织13例（经膀胱前列腺摘除术中获得）。膀胱肿瘤患者术后常规行羟基喜树碱膀胱内灌注化疗。肿瘤标本均行ＨＥ染色诊断,按ＷＨＯ病理分级标准,G1 32例,G2 17例,G3 10例;按ＵＩＣＣ临床分期,Ｔ1  34例,Ｔ2 15例，T3 4 10例。其中未经化疗的初发肿瘤30例,化疗后复发肿瘤29例。单发性肿瘤42例，多发性肿瘤17例。送检标本用10%中性福尔马林固定24h。

    1.2  方法

    1.2.1  实验方法链霉卵白素（SP）两步法免疫组化技术检测59例膀胱移行细胞癌和13例正常膀胱组织标本中P?gp、MRP、Bcl?2、Bax的表达情况。SP试剂盒为美国ZYMED产品。P?gp、MRP、Bcl?2、Bax多克隆抗体由北京中杉公司提供。取材后石蜡包埋,常规5μm切片、烤片2h。脱蜡至水、PBS缓冲液浸泡10min，EDTA 9.0抗原微波修复30min,新鲜配置的3%双氧水、封闭用血清孵育10min，加一抗4℃孵育过夜,PBS缓冲液冲洗10min,加二抗孵育15min,PBS缓冲液冲洗10min,滴加链霉卵白素孵育15min，镜下控制ＤＡＢ显色液,自来水冲洗10min,苏木精染色液复染，乙醇、二甲苯常规脱水、透明，中性树胶盖玻片封片。P?gp、MRP采用肾癌组织，Bcl?2、Bax采用前列腺增生组织作阳性对照（阳性对照片由北京中杉公司提供），PBS代替一抗作为阴性对照。

    1.2.2  结果判定  对不同分组的膀胱癌组织中各蛋白表达情况进行比较时，用阳性表达细胞数量的分值和染色强度的分值两项加权法[1]：连续随机察看10个高倍视野，以定位明确的阳性表达细胞<1%为0分，1% 5%为0.5分，6% 25%为1分，26% 50%为2分，51% 75%为3分，>75%为4分；以阳性细胞染色强度出现淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。将每一标本两项得分相乘得出总分0 4分为阴性，>4分为阳性。

    1.3  统计学处理

    应用SAS 8.0统计分析软件,采用卡方检验和Spearman秩相关分析。

    2  结    果

    2.1  P?gp、MRP、Bcl?2、Bax的表达

    初发膀胱移行细胞癌组织中P?gp、MRP、Bcl?2、Bax阳性表达分别为50%(15/30)、47%(14/30)、30%(9/30)、70%(21/30)；化疗后复发膀胱肿瘤组织中P?gp、MRP、Bcl?2、Bax阳性表达分别为86%(25/29)、68%(20/29)、62%(18/29)、55%(16/29)；正常对照P?gp、MRP、Bcl?2、Bax阳性表达分别为7.7%(1/13)、7.7%(1/13)、7.7%(1/13)、15%(2/13)。正常膀胱组织、初发膀胱肿瘤组织、化疗后复发膀胱肿瘤组织内P?gp、MRP、Bcl?2、Bax表达两两比较都有显著性差异（均P＜0.05）。多发性肿瘤中P?gp、Bcl?2的表达明显高于单发性肿瘤，Bax表达明显低于单发性肿瘤（表1）。免疫组化染色显示P?gp、MRP抗原呈棕黄色，主要表达在细胞膜；Bcl?2、Bax抗原呈棕黄色或深棕黄色，主要表达在细胞质（图1）。    表1  多发性与单发性肿瘤P?gp与Bcl?2、Bax

    2.2  膀胱癌中P?gp、MRP、Bcl?2、Bax的表达与病理分级、分期的关系

    P?gp表达水平与病理分级、临床分期密切相关，G2、G3级膀胱肿瘤阳性率分别是G1级的7.5、9.0倍（均P＜0.05），T2、T3 4分别是T1期的7.3、10倍（均P＜0.05）。MRP与肿瘤的分期分级无关（P＞0.05）。浸润性肿瘤（T2 T4）或G2、G3肿瘤组织中的Bcl?2表达水平明显高于浅表性肿瘤（Ta 1期）或G1肿瘤组织(均P<0.01)，G2、G3级膀胱肿瘤阳性率分别是G1级的8.5、14倍（均P＜0.05），T2、T3 4是T1期的6、11倍（均P＜0.05）。而浸润性肿瘤（T2 T4）或G2、G3肿瘤组织中的Bax表达水平与浅表性肿瘤或G1肿瘤组织相比则明显下降（均P＜0.05），G2、G3级膀胱肿瘤阳性率分别是G1级的0.25、0.18倍（均P＜0.05），T2、T3 4是T1期的0.17倍（均P<0.05）。见表2。    表2  膀胱癌中P?gp、MRP、Bcl?2、Bax的表达与病理分级、分期的关系 注：括号为百分数

　　2.3  膀胱移行细胞癌病例P?gp与Bcl?2、Bax表达关系

    P?gp、Bcl?2、Bax表达变化均与腔内化疗有关，P?gp蛋白表达与Bcl?2呈正相关（r=0.78，P<0.05）,与Bax呈负相关（r=-0.5，P<0.05）。P?gp与Bcl?2、Bax表达密切相关。见表3。表3  膀胱癌病例P?gp与Bcl?2、Bax的关系

    3  讨    论

    3.1  P?gp与MRP

    P?gp是由MDR1编码的蛋白，与MRP同属于ATP结合盒式转运蛋白超家族成员,均可以能量依赖性地将药物泵出细胞外,减少药物转运入细胞内从而使细胞内蓄积药物减少。此外,还可使细胞内药物再分布而进一步减少作用靶点部位的药物浓度[2]。 MRP与P?gp在结构和功能上有许多相似之处，也是一种依赖能量的药泵，该家庭成员目前最少有8种（MRP1?MRP8）。MRP作用机制与P?gp表达无关，而与细胞内MRP的药物泵作用有关，它能识别和转运与谷胱甘肽（glutathione GSH）结合的底物，故又称为GSH?X泵，从而降低细胞内的药物浓度，增加药物外流产生耐药[3]。研究表明，不表达MDR1基因的体外细胞株EJ/DOR产生多药耐药（MDR）的主要原因是MRP过表达及DNA拓朴异构酶表达下降,这种非P?gp介导的MDR可能发生于膀胱癌化学过程中[4]。尽管MRP与P?gp表达的确切关系尚未明确，甚至有相反的结论，但种种迹象表明MRP既可与P?gp协同产生MDR，亦可独自介导MDR。

    3.2  P?gp与Bcl?2、Bax

    Bcl?2家族其中最重要的两个成员是Bcl?2和Bax。张磊等[5]研究了40例膀胱癌组织和24例正常膀胱组织的Bcl?2表达，发现正常膀胱组织中无表达，而膀胱癌组织中Bcl?2蛋白表达率为60%，并且阳性率随着组织分级的增高而升高。另有研究表明在耐药株BIU287/ADM中Bcl?2表达明显高于敏感株BIU287;而将反义Bcl?2基因转染至耐药株细胞中后则能明显提高后者对抗癌药物的敏感性[6]。Bax基因和Bcl?2基因是一对正负凋亡调节基因，Bax不但拮抗Bcl?2基因的抑制凋亡作用,而且有直接促进细胞凋亡的功能。Bcl?2和 Bax蛋白相结合,形成异二聚体，Bcl?2/Bax的值对于决定细胞接受刺激信号后存活与否起关键性的作用。

    P?gp作为MDR1基因的表达产物，除了具有排出泵功能外还可能存在抗凋亡作用，过表达的P?gp可经尚未明确机制活化PI?3K通路,进而间接抑制细胞凋亡。此外,P?gp还可经过抑制Bax及凋亡关键酶,直接抑制细胞凋亡[7]。Bcl?2耐药机制与P?gp介导的MDR全然不同，Bcl?2不阻止药物进入细胞内，不抑制药物引起的DNA损伤,也不改变细胞对DNA的修补速率和细胞周期动力学。亦有研究表明，凋亡基因可以直接或间接参与MDR1调控。目前参与MDR1调控的癌基因主要是与细胞增殖启动有关的部分,如Ras、Raf、突变型p53等,它们通过直接刺激MDR1表达,或失去抑制作用间接导致MDR1表达,或几种癌基因联合发挥作用。Bcl?2基因及其编码的Bcl?2蛋白可使细胞对多种因素介导的凋亡产生抗性[8?9]，而Sampath等[10]研究发现,突变的ｐ53可以明显上调MDR1启动子活性,野生型ｐ53则有特异抑制效应。抗凋亡基因Bcl?2可在细胞周期的多环节上阻断野生型ｐ53诱导的凋亡和细胞周期停滞,从而使MDR1过度表达，当抗凋亡机制占主动时,肿瘤细胞凋亡率明显下降,此时肿瘤显示对化疗不再敏感。关于P?gp与Bcl?2表达的确切关系目前国内外尚未明确，Bcl?2家族内成员关系密切，因此P?gp与Bcl?2家庭关系值得进一步研究。

    膀胱肿瘤多药耐药的形成机制同其他恶性肿瘤一样复杂多样，任何单一的机制都不可能圆满解释其耐药原因。膀胱黏膜上皮细胞增殖和凋亡的调控机制迄今尚未完全明了,除Bcl?2和Bax外,一些生长因子、癌蛋白以及它们之间的相互作用在膀胱黏膜组织细胞增殖与凋亡中发挥着重要作用。它们之间的平衡失调可能是膀胱癌发生的基础,对每种可能耐药机制进行深入研究是完全必要的,这样可以设计出针对某种耐药机制的特异性拮抗药物或方法应用于临床逆转MDR,可能会有针对性更强、效果更好的逆转效应，同时可望进一步明了膀胱癌的病因和发病机制,并为临床治疗和判断预后、复发提供理论依据。

【】
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