平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究

         作者：朱磊，吴小涛，董寅生，王运涛，邱匀峰，张福勇，鲍军平

【摘要】  目的：探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。方法：体外培养兔髓核细胞，分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组，利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察，MTT法测定各组髓核细胞增殖情况，HE染色、免疫组化分析髓核细胞Ⅱ型胶原的表达，阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖（GAG）含量。结果：经过两周的培养，两组髓核细胞均能够增殖；与平面培养组相比，三维培养组细胞增殖率、Ⅱ型胶原表达量、GAG合成量均增高（均P<0.01）。结论：髓核细胞能够与PLGA支架很好地黏附并增殖；PLGA支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖，提高Ⅱ型胶原和GAG的合成量，可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法。

【关键词】  椎间盘退变； 髓核细胞； 组织工程； PLGA支架； 三维培养；兔

    椎间盘退变性疾病(intervertebral disc degeneration disease，IDDD)是一类具有高发病率及高致残率的骨科疾病。临床常用的保守和手术治疗方法不能从根本上逆转椎间盘细胞的退变，远期效果不佳。椎间盘组织工程学的迅速为IDDD提供了一种新的生物学治疗方法，其目的是通过逆转椎间盘细胞水平的病理改变，进而修复和重建退变的椎间盘组织。髓核细胞的退变在椎间盘退变中起了关键性作用，因此，如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞是椎间盘组织工程学要解决的核心问题。国外学者利用组织工程学方法，对髓核细胞的培养进行了大量的研究，但利用组织工程聚乳酸(PLA)/聚羟基乙酸(PGA)复合生物材料PLGA支架三维培养髓核细胞，国内外报道尚少。本实验通过探讨兔髓核细胞平面和PLGA支架三维培养对其增殖及基质合成的影响，为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物

    4周龄新西兰大白兔（东南大学实验动物中心提供）10只，体重（500±30）g，雌雄不拘。

    1.2  主要仪器、材料和试剂

    CO2孵箱（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（德国Zeiss公司），扫描电镜（日立H- 7650型），PLGA 支架（东南大学材料与工程学院提供），胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶（美国Gibco公司），D- Hank液（德国Biochrom公司），胎牛血清（杭州四季青公司），DMEM/F12培养基、抗坏血酸、二甲亚砜(DMSO)、MTT、阿利新兰试剂、多聚赖氨酸（PLL）（美国Sigma公司），Ⅱ型胶原免疫组化一抗（武汉博士德公司），多孔培养板（美国Corning公司）。

    1.3  实验方法

    1.3.1  髓核细胞的分离获取和培养  取4周龄小乳兔，0.5%戊巴比妥钠0.1 mg·kg-1肌肉注射处死，无菌条件下将胸腰段脊柱整段取出，尽量剥尽椎间盘前缘所附着的肌肉，以D- Hank液（含青霉素100万U·L-1和链霉素1 g·L-1）冲洗2遍，尖刀切开椎间盘纤维环，用眼科镊将胶冻状椎间盘髓核完整取出，以DMEM/F12（含青霉素10万U·L-1和链霉素0.1 g·L-1）漂洗3遍后，吸取到0.25%Ⅱ型胶原酶液中，37 ℃ 消化15～20 min，期间用吸管轻轻吹打，待组织大部分消化、培养液浑浊后用200目不锈钢网过滤，悬液1 000 r·min-1离心8 min，混悬计数细胞，以1×105ml-1浓度接种到培养瓶中，生长培养液为DMEM/F12（含15%优质胎牛血清、抗坏血酸30 μg·ml-1、青霉素10万U·L-1、链霉素0.1 g·L-1，pH 7.0），置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。每天倒置显微镜观察细胞生长情况，2 d换液1次。另取部分原代培养的细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定。

    1.3.2  PLGA支架材料的预处理和实验分组  先将已经制备好的PLGA支架材料用无菌手术刀片切割成周径10 mm、高3 mm的圆柱体，以75%酒精浸泡30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）反复冲洗后，培养箱内晾干，滴加适量（2.5 μg·ml-1）多聚赖氨酸（poly-l-lysine，PLL）浸没支架材料，静置4 h，吸掉多余液体，完成包被，备用。

    将接近90%融合的原代髓核细胞弃去培养液，加入少量0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，培养液漂洗2次后，用生长培养液DMEM/F12混悬细胞，计数制成1×106 ml-1细胞悬液。

    将制成的髓核细胞悬液分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组培养。

    1.3.3  髓核细胞的形态学观察  平面培养组：取2 ml 细胞悬液直接接种于6孔培养板中，共6孔，置于37 ℃、 饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，2 d换液1次，每日倒置显微镜观察并定期摄像。PLGA支架三维培养组：取包被后的PLGA支架8块，无菌条件下放置到两块6孔培养板中，每块支架材料内先滴加细胞悬液1 ml，培养1 h后翻转，再在另一面滴加1 ml细胞悬液，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，2 d换液1次，每日倒置显微镜观察并定期摄像。任选2块细胞支架复合物标本，在培养1周后弃掉培养液，PBS漂洗2遍后加适量4 ℃预冷3%戊二醛，4 ℃固定2 h，PBS浸洗，10 min×2次，梯度酒精脱水15 min×2次。标本经乙腈置换、真空干燥、真空导电处理后进行扫描电镜观察摄像。

    1.3.4  MTT法检测两组细胞增殖情况  取24孔培养板两块，一板每孔直接接种浓度为1×106 ml-1的细胞悬液1 ml，共24孔，作为平面培养组；另一板每孔放入包被后的PLGA支架1块，将浓度为1×106 ml-1的细胞悬液1 ml接种到材料上，共24孔，作为PLGA支架三维培养组。两组均为24孔，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养，2 d换液1次，培养两周，于接种后第2、5、9、14天各组分别取6个复孔，每孔加入MTT（5 mg·ml-1）100 μl，37 ℃继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 1 ml，振荡10 min后，吸取各孔液体150 μl于96孔培养板，酶标仪于490 nm波长下检测各孔光密度值（OD值）。

    1.3.5  HE染色、免疫组化分析两组髓核细胞Ⅱ型胶原的表达  同1.3.3方法，将髓核细胞分为两组接种培养：两组各6孔，置于37 ℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中，2 d换液1次，两组细胞各培养两周。由于前面实验已经证实原代平面培养的细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性，主要着色部位是胞浆，细胞基质不表达Ⅱ型胶原，故将其中平面培养组髓核细胞在第10天时弃去培养液，加入少量0.25%胰蛋白酶消化细胞，倒置显微镜下观察，见细胞回缩、间隙增大时吸去消化液，加入适量含血清的培养液终止反应，用吸管轻轻吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液。1 000 r·min-1离心5 min，弃上清，培养液漂洗2次后，用生长培养液DMEM/F12混悬细胞，制成细胞悬液，接种于PLGA支架，继续培养至第14天，以利于Ⅱ型胶原从胞浆分泌到细胞外基质，便于与PLGA支架三维培养组标本统一切片分析。于第14天取出两组支架材料每组6块共12块，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色。免疫组化（SP法）检测两组髓核细胞Ⅱ型胶原的表达，一抗为鼠抗兔抗Ⅱ型胶原的单克隆抗体（1∶50），二抗为生物素化鼠抗鼠IgG多克隆抗体（1∶500），DAB显色。免疫组化结果判断：Ⅱ型胶原阳性细胞间质呈棕褐色。应用LeicaQ 550IW机图像分析系统及其软件（LeicaQwinPro.2.2）定量评价呈阳性免疫组化染色的髓核细胞间质的灰度值（灰度分级0～255级，0级为最深，255级为最浅），两组每块支架分别取3张切片，每张切片随机采集3个高倍视野进行测定（×200， 向同一个方向移动切片，不重叠，不重复），测得结果取平均值，作为每张切片视野内棕褐色的平均灰度值，再取每块支架的3张切片的灰度平均值，作为每块支架髓核细胞Ⅱ型胶原表达的间接数值。

    1.3.6  阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖（GAG）含量  收集1.3.3中（两组各6孔）每次更换的培养液，-20 ℃冰箱保存，备检。两组细胞各培养两周，将两组细胞培养时所收集的培养液和等体积的新鲜培养液（作为空白液）分别加入1.5倍体积的异丙醇沉淀蛋白，使用阿利新兰染色法，以6-硫酸软骨素（6- CS）溶液为标准品，计算所收集的两组细胞培养液中GAG含量。

    1.4  统计学处理

    所得数据用x-±s表示，输入SPSS 11.5统计学软件进行统计学处理，组间比较采用t 检验。

    2  结    果

    2.1  髓核细胞形态学观察结果

    倒置显微镜下可见原代单层培养的髓核细胞48 h 后开始贴壁，细胞为多角形或梭形，呈岛状生长，胞浆内含有少量空泡，贴壁后伸出伪足。原代培养的细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性，主要着色部位是胞浆，细胞基质和细胞核不着色。原代髓核细胞大约15 d左右达到90％融合。传至第1代后分为平面和PLGA支架三维培养，平面培养的髓核细胞保持原代多角形或梭形的细胞形态（图1A），PLGA支架三维培养组倒置显微镜下显示髓核细胞转为圆形或类圆形，48 h后开始黏附在支架边缘，随着时间的推移，细胞和支架表面结合更加紧密，由原位向周围增殖、爬行，并逐渐向支架网孔中长入，细胞间接触增多，支架孔隙结构存在，支架暴露面逐渐减小。培养1周后进行扫描电镜观察，可见PLGA支架呈网状结构，在支架的网状孔眼中可见圆形或类圆形髓核细胞黏附，呈单个或者多个细胞簇样生长（图1B）。

    2.2  MTT法检测两组细胞增殖结果

    如表1所示，各组OD值随培养时间的延长而增大，间接反映了各组细胞数随时间的增加而增加。培养各时段，除分组培养后的第2天差异无统计学意义外，PLGA支架三维培养组在第5、9、14天均高于平面培养组，差异有非常显著的统计学意义（P＜0.01）。表1  两组髓核细胞增殖结果（OD值）比较 PLGA支架三维培养组   6   0.293 6±0.002 6   0.424 6±0.003 21）   0.585 8±0.004 41）   0.763 2±0.006 51）    1）与平面培养组比较，P＜0.01

    2.3  HE染色、免疫组化分析两组细胞Ⅱ型胶原表达结果

    两组细胞支架复合物切片HE染色，可见两组髓核细胞呈圆形或类圆形，细胞基质均有大量胶原组织，但PLGA支架三维培养组细胞基质胶原组织较平面培养组细胞基质胶原组织要致密很多，着色更加明显（图2A、B，见封三）。免疫组化显示两组细胞基质Ⅱ型胶原均呈棕褐色的阳性反应，胞浆几乎不着色（图3A、B，见封三）。经图像分析软件测得每张切片视野内棕黄色的平均灰度值，再取每块支架的3张切片的灰度平均值，作为每块支架髓核细胞Ⅱ型胶原表达的间接数值，结果，PLGA支架三维培养组Ⅱ型胶原表达高于平面培养组，统计学差异非常显著（P＜0.01）。见表2。表2  两组髓核细胞Ⅱ型胶原合成定量分析和培养液中GAG含量

    2.4  阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的GAG含量结果

    见表2。PLGA支架三维培养组培养液中髓核细胞合成的GAG含量明显高于平面培养组（P＜0.01）。

    3  讨    论

    以椎间盘突出症为主要代表的一系列IDDD临床上常用的方法是保守治疗和手术治疗。前者常出现复发；而手术治疗为有创治疗，会破坏脊柱的稳定性和完整性，伴有许多并发症。理想的治疗方法是针对退变的原因，通过人工干预，早期阻止或逆转椎间盘细胞水平的退变，恢复其生物学功能，即椎间盘退变的生物学治疗。近几年来，椎间盘组织工程学成为骨科生物学研究的新领域，为IDDD的生物学治疗提供了新的思路，其目前的研究主要集中于种子细胞的选择、接种培养种子细胞的生物载体支架材料以及相关生长因子三方面。

    种子细胞的选择是椎间盘组织工程的核心所在，由于髓核细胞的退变在椎间盘退变中起了关键性作用，因此选择髓核细胞作为种子细胞着手研究是比较适宜的。如何获得足量的具备正常生理功能的髓核细胞，国外学者就这一问题进行了大量的研究［1- 4］，获得了良好的结果，结论提示了髓核细胞体外平面培养增殖缓慢，三维培养可以促进其增殖和细胞外基质分泌，其形态学亦发生变化。

    对椎间盘组织工程种子细胞支架材料的选择也是国内外学者研究的热点。理想的支架材料应该为种子细胞提供良好的生长和代谢微环境，利于细胞黏附生长、营养成分渗入、进行气体交换和排除代谢产物，并使细胞按预制形态的三维支架生长［5］。这就要求支架材料在具有三维立体结构、高孔隙率、生物可降解性、可塑性和一定的机械强度以及良好的组织相容性等特性的同时,更具有良好的表面活性，这样更有利于细胞的黏附，并为细胞在其表面生长增殖、分泌基质提供良好的微环境［6］。

    本实验选用东南大学材料与工程学院提供的PLA/PGA复合生物材料PLGA支架作为髓核细胞三维培养的支架。PLGA从20世纪早期就开始被应用于临床，具有优良的组织相容性，无免疫反应，安全性好，在体内的最终降解产物是水和二氧化碳，并随尿液和呼吸排出体外，不会在体内聚集，现已被成熟应用于骨科的可吸收螺钉等体内可降解埋植材料。此外，PLGA还具有下列优点：（1）有一定的机械强度，在机体内保持自身形状并能抵抗适度的外力作用；（2）易于塑形；（3）可与其它生物活性分子如骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子-β（TGF- β）复合、控释，从而对种子细胞的生长进行调控。PLGA支架的孔径还可以依据不同细胞的生长要求进行调节，Bucholz［7］认为支架的孔径必须大于100 μm，否则组织仅能侵入植入物的表面且组织内不易得到充分的养料，另一方面，过大（>600 μm）的孔径也会影响材料强度和细胞的黏附。根据国外要求，东南大学材料科学与工程学院制作的PLGA支架具有良好孔隙结构，呈可切割的圆柱状，支架孔隙尺寸为400～600 μm，孔隙率大于90%，分布均匀，相互连通，采用冰粒子作为致孔剂，以冷冻干燥过程代替传统粒子滤出法的致孔剂滤出过程，既保留传统的粒子滤出法能够调节孔隙大小的特点，又保留了冷冻干燥技术无致孔剂残留的优点［8］，保证了髓核细胞生长的安全性。

    种子细胞与支架材料的相互作用也是组织工程研究的主要领域，其中细胞与材料的黏附是基础。细胞必须与材料发生适当的黏附，才能进行迁移、增殖和分化。有机高分子材料缺乏细胞识别的信号，细胞亲和性差。本实验用PLL作为细胞信号识别分子包被PLGA，促进髓核细胞在材料上的黏附，实验结果表明：髓核细胞48 h后就开始黏附在支架边缘，并逐渐向支架网孔中长入，1周后扫描电镜观察，可见支架网状孔眼中有髓核细胞黏附，转变并保持其立体生长圆形或类圆形的形态，并呈单个或者多个细胞簇样生长，证实PLL包被实现了PLGA支架表面生物化,使支架表面形成一个能与髓核细胞相适应的过渡层。

    IDDD都是以髓核细胞数量减少和功能降低，导致细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原量进行性下降为共同表现，因而，获得足量的具备正常基质合成功能的髓核细胞是该病生物学治疗的主要目标。我们在观察到髓核细胞在PLGA支架上较平面培养能更快增殖的同时，也观测了支架对髓核细胞基质Ⅱ型胶原和GAG合成的影响。Gruber等［9］研究发现平面培养时髓核细胞基质几乎无Ⅱ型胶原表达，利用免疫组化的方法只有三维培养中才能检测出基质中有Ⅱ型胶原，而蛋白多糖合成不受培养方式的影响，我们的研究结果与Gruber等的结果是一致的。在髓核细胞原代培养时，行细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化染色，结果显示着色部位是胞浆，细胞基质和细胞核不着色。我们将平面培养组髓核细胞于第10天时接种于PLGA支架，继续培养至第14天，以利于Ⅱ型胶原从胞浆分泌到细胞外基质，便于与PLGA支架三维培养组标本统一切片分析，结果显示转为三维培养后，细胞外基质有Ⅱ型胶原分泌，但量比三维培养组少许多。蛋白多糖是由核心蛋白和GAG通过共价键联结而成的，因此，检测培养液中GAG的含量，可以代表髓核细胞蛋白多糖的合成量。我们用阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的GAG含量，结果显示三维培养组远高于平面培养组。

    我们的研究表明，与平面培养相比，PLGA支架三维培养能够促进髓核细胞增殖，并能提高Ⅱ型胶原和GAG的合成量，这一结果可能与三维支架立体环境能容纳高密度的细胞黏附，使得髓核细胞间能够有机会更密切地接触，更容易增加细胞之间的联系，有利于细胞间信号传递，从而通过某种机制相互作用有关。三维培养体系为维系细胞的增殖和代谢活动提供了适宜的微环境，各种生长因子等细胞外基质成分可良好地固守在细胞附近，而不像单层培养时，细胞外基质易于流失到培养液中，因此细胞外基质对细胞增殖分化及代谢的调节作用，可以在三维支架培养中得以充分发挥。国外利用新型生物反应器进行细胞三维培养的报道也很多［10］，可以保持培养液的动态循环，促进支架孔隙间营养物质交换和代谢产物排出，保证细胞在长时间培养时的可持续性增殖，这也是我们将来研究需要改进之处。总之，我们的研究证明了PLGA支架三维培养髓核细胞可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法，利用组织工程学将种子细胞支架复合物植入或者将种子细胞直接注入病变椎间盘［11］，是我们后续的研究方向。当然，要实现将椎间盘组织工程学应用到实际临床治疗，打破椎间盘退变、突出的恶性循环，完成椎间盘的生物学修复这一目标，我们还有很长的路要走。

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