西地那非对高氧所致肺损伤模型新生鼠的保护作用

【摘要】  目的：观察西地那非对高浓度氧暴露后新生大鼠肺组织形态学改变的影响,并探讨其机制。方法：80只足月新生SD大鼠随机分为空气加生理盐水对照(A)组、空气加西地那非(B)组、高氧加生理盐水对照(C)组和高氧加西地那非(D)组4组。C、D组输入高体积分数氧(FiO2 0.85),B、D组每天予西地那非100mg·kg－1背部皮下注射。在实验第14天观察肺组织病理改变、放射状肺泡计数(RAC),并且用免疫组化法测定肺组织内皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白水平。结果：D组肺组织病理改变减轻,RAC和肺微血管数目高于C组(7.340±0.620 vs 5.013±0.738，P＜0.001；3.855±0.717 vs 2.375±0.705，P＜0.001)，且B、D两组肺组织eNOS表达明显增加(均P＜0.001)。结论：西地那非对高氧所致肺损伤具有一定的保护作用，其机制可能与西地那非降低肺内血管压力及促进肺微血管生成并增加eNOS的表达有关。

【关键词】  西地那非； 高压氧； 肺； 新生大鼠

    氧疗是儿科常用的治疗措施,可提高动脉血氧分压,改善组织缺氧。但在肺发育不成熟的早产儿中,长时间高浓度的氧疗易造成肺损伤,甚至导致患儿病死率增加,其中常见的慢性肺部疾病支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD) 即与氧疗密切相关。该病以肺发育停滞为主要病理表现，但其发病机制尚未完全阐明,治疗也在探索中。西地那非为5′- 磷酸二酯酶选择性抑制剂，临床主要用于治疗勃起功能不良及中重度肺动脉高压。有研究表明［1］，在婴幼儿肺动脉高压动物模型中,西地那非能高选择性地扩张血管,降低肺血管阻力,从而有效地降低肺动脉压力,增加心输出量。由于对这些新功能的认识,临床上对西地那非的新用途产生了浓厚的兴趣。本实验予足月新生Sprague- Dawley (SD)大鼠持续吸入高浓度氧(FiO2=0.85)14d造成高氧肺损伤模型［2］，同时予西地那非皮下注射治疗,通过观察对比各组间肺组织形态学改变、肺放射状肺泡计数(RAC)、肺内微血管计数等，观察西地那非对高氧肺损伤大鼠模型肺组织形态学的影响,并进一步探讨西地那非的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    西地那非注射液由药科大学药学研究所根据［3］的方法，用西地那非片剂（批号B- 2103- 0001- 888888，辉瑞制药有限公司）制成。小鼠抗大鼠eNOS抗体、羊抗大鼠CD31抗体购自Santa Cruz公司,即用型SABC及DAB显色剂购自北京中杉生物公司。

    1.2  方法

    1.2.1  动物模型制备

    生后12h内SD大鼠80只，雌雄不限（由东南大学医学院动物中心提供），随机分为空气加生理盐水对照组(A组)、空气加西地那非组(B组)、高氧加生理盐水对照组(C组)及高氧加西地那非治疗组(D组) 4组,每组20只。C、D组新生鼠置于玻璃氧箱,持续输入氧气,通过测氧仪使氧体积分数维持在0.85±0.02(美国OM- 25ME型测氧仪监测)。A、B组新生鼠则置于同一室内,接受常压空气。高氧暴露组每天开箱1次(更换垫料、钠石灰、水及饲料,注射药物,并与空气组互换母鼠以避免母鼠因氧中毒致护理能力下降,开箱总时间不超过1h)。维持室内温度23～25℃,湿度50%～70%。B、D组每天皮下注射西地那非100mg·kg-1，A、C组接受等量生理盐水。

    1.2.2  实验标本的采集及检测方法

    1.2.2.1  标本采集、制作  每组分别于实验第14天腹腔注射10%水合氯醛3ml·kg-1麻醉后摘眼球放血随机处死,将右肺上两叶置于40g·L-1中性甲醛中固定,4℃过夜,石蜡包埋,制作5μm组织切片,用于肺形态学观察。

    1.2.2.2  肺组织CD31和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）免疫组化检测  石蜡切片常规脱蜡至水,30g·L-1过氧化氢室温处理10min，抗原修复，血清封闭，滴加一抗CD31 (稀释1∶75)或eNOS(稀释1∶250),37℃孵育2h，滴加生物素标记二抗,37℃孵育30min，加辣根酶标记的链霉卵白素,37℃孵育30min，DAB显色。用已知阳性片作为阳性对照,PBS液代替一抗为阴性对照。采用MetaMorph图像分析软件,以平均积分光密度值表示eNOS阳性染色的强度,其与染色程度呈正相关,进行肺组织eNOS蛋白表达的半定量。

    1.2.2.3  肺形态学观察  每只动物随机抽取切片5张,每张切片于光镜下随机选取5个视野。(1)组织切片行HE染色后光镜观察。(2) HE染色切片,从呼气性细支气管中心至远端胸膜引一垂直线,计数该直线上肺泡数量即为RAC。每张切片10次计数,取平均值。(3)光镜(×100)下计数阳性染色的微血管数目（CD31为血管内皮特异标志,可反映毛细血管数目及形态的改变）。

    1.3  统计学处理

    应用SPSS13.0软件进行处理,数据均以x-±s表示。各组间采用One- Way ANOVA检验,两两比较采用SNK(q)检验。

    2  结    果

    2.1  大体观察

    A、B组大鼠两肺呈粉红色,质软且弹性较好；C组两肺较苍白,部分肺叶呈暗红色，可见点状出血灶；D组双肺多数呈粉红色，偶呈暗红色，可见少量点状出血灶。

    2.2  光镜观察

    A、B组肺泡毛细血管丰富,肺泡均匀,肺间隔较薄,其中B组血管增生较明显。C组肺泡数量明显减少,部分肺泡壁扩张、融合,形成肺大泡；肺泡毛细血管明显减少；肺内散在灶状出血和不张；肺间隔明显增宽,其内成纤维细胞及胶原样物质明显增多；肺泡结构紊乱,部分萎陷,符合BPD的病理改变。D组病理改变较C组明显减轻，肺泡毛细血管丰富,肺泡腔内散在红细胞渗出,间隔增厚不明显,未见胶原沉积。见图1。

    A～D依次为A～D组

    图1  各组新生大鼠肺组织学改变  HE×200

    2.3  各组RAC、微血管计数和eNOS蛋白表达的变化

    eNOS染色阳性信号均为棕黄色颗粒,定位于胞浆；阴性对照无阳性染色。eNOS在各组均主要分布于气道上皮细胞及血管内皮细胞,其中C、D组肺泡巨噬细胞也有阳性表达,中性粒细胞无阳性染色。14d 时C组表达强度较A组明显升高(P<0.01),D组表达强度较C组明显升高(P<0.01)。见图2、表1。表1  各组新生大鼠RAC、微血管计数和eNOS表达的变化注：F(RAC)=252.179； F(微血管计数)=108.263； F(eNOS)=42.31

    3  讨    论

    BPD是多种病因共同作用的结果，其中发育不成熟与BPD发生的相关性最大［4］。由于产前糖皮质激素、表面活性物质的使用和机械通气技术的改进，导致BPD的表现和以前刚提出来时有了很大的不同，其病理特点已由过去严重的呼吸道损伤、局灶性肺过度膨胀和间质纤维化转变为以肺泡结构简化和血管生长异常为特征的肺发育阻滞［5］。因此，促进肺微血管的生长是否能够预防和改善BPD的产生和成为国内外研究的热点问题。

    西地那非是一种5′- 磷酸二酯酶(PDE5)的选择性抑制剂。PDE5存在于肺血管平滑肌细胞中,影响3′,5′- 磷酸鸟苷的循环代谢。国外有学者研究PDE5抑制剂在婴幼儿肺动脉高压动物模型中的作用,认为它能高选择性地扩张血管,降低肺血管阻力,有效地降低肺动脉压力,增加心输出量,而对体循环的血流动力学无影响。在早产儿，吸入NO可以作为BPD预防性的一种措施［6］。NO由一氧化氮合酶(NOS)催化L- 精氨酸(L-Arg)与氧分子经多步氧化还原反应生成。NOS目前已知有3种异构体，其中eNOS为结构型酶,主要通过Ca2+/钙调蛋白依赖途径持续合成基础水平的NO,在调节气道和血管紧张性、抑制血小板聚集、对抗中性粒细胞附壁和激活等生理活动中发挥重要作用。高氧时肺eNOS表达的增加可能是对损伤的一种保护性反应［7］。

    本实验中，足月新生鼠高氧暴露14d后出现肺泡间隔增宽,炎症细胞浸润,肺间质细胞明显增加。病变严重区正常结构被破坏,肺泡腔明显增大,肺泡融合，肺泡数量明显减少，而且肺微血管密度下降。而予以西地那非的治疗组，肺泡发育得到改善，肺微血管的生成增多。由此证实了西地那非具有促进肺微血管及肺泡生成的作用，对抗了高氧条件导致的肺微血管及肺泡的减少。同时本实验进一步探讨西地那非的可能作用机制。用免疫组化方法证实予西地那非的两组eNOS蛋白的含量都高于未用西地那非对照组，说明西地那非有促进eNOS产生的作用;另一方面，由于西地那非通过抑制磷酸二酯酶,进而增加了cGMP的浓度,使内源性的NO更持久地起效,不仅扩张正常的肺血管,也使病变肺组织的血管扩张。这可能是西地那非治疗组肺泡发育得到改善的原因。

    由于西地那非早已应用于临床,较为安全,且现在已经有口服剂型，可以作为新生儿临床治疗肺损伤及预防BPD的一种新的药物，因此期待在其作用机制及用法、用量等方面有更进一步的研究发现。

【】
  ［1］SHEKERDEMIAN L S,RAVN H B,PENNYD J，et al.Intravenous sildenafil lowers pulmonary vascular resistance in a model of neonatal pulmonary hypertension［J］.Respir Crit Care Med，2002，165(8):1098- 1102.

［2］刘雪雁,吴捷,薛辛东.高氧致新生鼠肺损伤时肾组织一氧化氮及氧自由基的变化［J］.当代儿科杂志,2005,7(1):71- 74.

［3］ICHINOSE F,ERANA- GARCIA J,HROMI J，et al.Nebulized sildenafil is a selective pulmonary vasodilator in lambs with acute pulmonary hypertension［J］.Crit Care Med，2001， 29(5):1000- 1005.

［4］VAUCHER Y E.Bronchopulmonary dysplasia:an enduring challenge［J］.Pediatr Rev，2002，23(10):349- 358.

［5］BANCALARI E.Bronchopulmonary dysplasia:old problem,new presentation［J］.Pediatr,2006，82(1):2- 3.

［6］SCHREIBER M D,GIN- MESTAN K,MARKS J D，et al.Inhaled nitric oxide in premature infants with the respiratory distress syndrome［J］.N Engl,2003，349:2099- 2107.

［7］WHITTLE B R.Nitric oxide in physiology and pathology［J］.Histo Chemical，1995,27(10):727- 737.