p38MAPK在慢性移植物抗宿主病狼疮样小鼠肾组织的表达研究

【摘要】  目的：探讨慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织p38MAPK的表达变化,进而分析p38MAPK在狼疮肾炎肾纤维化发生中的作用。方法：将12只雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠随机分为模型组及正常对照组,每组6只。于16周末处死，取肾行HE和Masson染色，应用免疫组化方法检测TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK在肾脏的定位表达，RT-PCR法研究各组肾组织TGF-β1、p38MAPK mRNA的表达,Western blot定量检测TGF-β1、p38MAPK、P-p38MAPK蛋白的表达水平，并观察两组小鼠24h尿蛋白排泄量。结果：与正常对照组比较,模型组小鼠24h尿蛋白排泄量、TGF-β1、p38MAPK和 P-p38MAPK蛋白及mRNA表达均明显增加(P＜0.01),TGF-β1与p38MAPK的表达呈正相关(r=0.418,P＜0.05)。结论：cGVHD狼疮样小鼠肾组织中TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK蛋白及mRNA表达明显上调,p38MAPK信号通路可能在狼疮肾炎肾纤维化的进程中起重要作用。

【关键词】  慢性移植物抗宿主病； 狼疮肾炎； p38MAPK； 小鼠

    狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus SLE）最重要的临床表现之一，其病理改变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，最终急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化不仅是各型LN进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，在其过程中，多种因素发挥着重要作用,其中TGF-β1起着关键作用。有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 级联是细胞内重要的信号转导系统,它参与胞外信号从表面转导到细胞内部的过程,为细胞内信息传递的共同通路。近年来许多研究结果表明，其亚族p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作为信号转导通路的交汇点在肾脏纤维化的发生发展中起着重要作用，但在LN肾纤维化的发生过程中是否起作用尚未见报道。因此本研究通过构建慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease,cGVHD)狼疮样小鼠模型,探讨作为TGF-β1下游信号介质，p38MAPK在LN发展过程中的表达与活化及其可能的作用机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物

    8～10周龄雌性(C57BL/6J×DBA/2)F1杂交鼠 (以下称杂交鼠)及6～7周龄DBA/2小鼠购自中山大学医学动物中心,体重(20.17±1.20)g,SPF级，饲养于本校公共卫生学院SPF动物房。

    1.2  模型的建立与分组

    ［1］制作cGVHD狼疮样小鼠模型。按随机、对照设计原则将12只杂交鼠分成模型组及正常对照组,每组6只。取DBA/2小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞,制成单细胞悬液(约60%脾细胞、30%胸腺及10%淋巴结细胞),分别于0、3、7、10d经尾静脉注射于模型组杂交鼠,用台盼蓝染色和细胞计数板计数,保证活细胞数大于95%,且每次给予细胞数为50×106个。正常对照组则于相应时间经尾静脉注射等体积生理盐水。两组小鼠首次尾静脉注射后每两周留取1次24h尿,至16周处死动物，立即取下肾脏,一部分置于-70℃低温保存,另一部分置于10%中性福尔马林溶液中固定后行组织病检查。

    1.3  24h尿蛋白量测定

    用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液1∶5稀释后按操作说明书操作。

    1.4  RT-PCR

    1.4.1  总RNA提取  从-70℃低温冰箱中取出肾组织,迅速用Trizol(晶美生物技术有限公司)匀浆提取总RNA。取5μl总RNA进行甲醛变性凝胶电泳,紫外灯下观察5、18、28s条带清晰提示RNA完整无降解。

    1.4.2  逆转录  逆转录反应体系如下:在PCR管中加入10×逆转录缓冲液1μl,MgCl2(25mmol·L-1)2μl,Oligo dT 1μl,dNTPs(10mmol·L-1)2μl,RNase inhibitor 0.25μl,AMV逆转录酶(TaKaRa公司)1μl,总RNA 2.75μl,30℃ 10min后42℃逆转录50 min,99℃灭活逆转录酶5 min,5℃ 5 min,所得cDNA保存于-20℃用于PCR扩增。

    1.4.3  PCR扩增  TGF-β1、p38MAPK及GAPDH内参照引物用DNA Club软件设计,由上海英骏生物工程公司合成,序列如下:p38MAPK上游引物5′-tcgagaccgtttcagtccat-3′,下游引物5′-ccacggaccaaatatccact-3′,产物为463bp；TGF-β1上游引物5′-tgcttcagctccacagagaa-3′,下游引物5′-cttgcgacccacgtagtaga-3′,产物为267bp；GAPDH上游引物5′-acttgaagggtggagccaaa-3′,下游引物5′-ccaggaaatgagcttgaca-3′,产物为608bp。反应体系:5×PCR缓冲液10μl,MgCl2 4μl,dNTPs 1μl,上下游引物各1μl,cDNA模板1μl,TaqDNA聚合酶(TaKaRa公司)0.25μl,补足双蒸水至50μl。Eppendorf AG 22331 PCR扩增仪扩增,p38MAPK条件为:94℃预变性3min；94℃变性30s,54℃退火40s,72℃延伸1min,循环36次；72℃终末延伸10min。TGF-β1改退火温度为56℃，其余与p38MAPK相同。

    1.4.4  产物检测  扩增产物在含0.5mmol·L-1溴乙锭的1%琼脂糖凝胶中以4～5V·cm-1电压降电泳30min。于Image Master VDS凝胶扫描仪上成像,用Totallab V 2.01凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有TGF-β1、p38MAPK扩增产物的吸光度均以GAPDH为基准校正,以TGF-β1/GAPDH、p38MAPK/GAPDH表示。

    1.5  病理检查

    2μm连续切片,置多聚赖氨酸包被的载玻片上,分别作HE和Masson染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。

    1.6  免疫组化检测

    SABC法免疫组化染色(试剂盒购自晶美生物技术有限公司)：取2μm厚石蜡切片脱蜡至水；加3%过氧化氢溶液,室温下孵育10 min；滴加胃蛋白酶修复抗原,37 ℃孵育15 min;加含10%羊血清的封闭液在室温下封闭30 min；滴加兔抗小鼠P-p38MAPK单克隆抗体(1∶100,Cell Signaling Technology公司),或兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗体(1∶100,Cell Signaling Technology公司)，或兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗体(1∶100,Santa Cruz公司)，4 ℃孵育过夜,37 ℃复温30 min；滴加生物素偶联的羊抗兔IgG抗体,37 ℃孵育30 min；加HRP标记的链亲和素,37 ℃孵育30 min；DAB显色,苏木素复染,中性树脂封片。阴性对照：以PBS替代一抗。

    1.7  Western blot

    取-70 ℃保存的肾皮质约100 mg,加入预冷的蛋白裂解液0.5 ml充分裂解。4 ℃ 3 000 r·min-1离心10 min取上清。测定蛋白质含量，取100 μg蛋白加入上样缓冲液,煮沸3 min后进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转PVDF膜,TTBS封闭液37 ℃封闭2 h,分别与兔抗小鼠TGF-β1多克隆抗体、兔抗小鼠p38MAPK多克隆抗体和兔抗小鼠P-p38MAPK单克隆抗体,4 ℃过夜,加入1∶2500稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗,37 ℃,2 h，DAB显色。每组重复3次。Western blot条带信号强度应用Kodak 1D图像分析软件进行定量分析。目的条带的相对含量=V目的条带/V对照组。对照组的相对含量为1.0，＞1.0为表达阳性。

    1.8  统计学处理

    计数资料以x-±s表示,采用SPSS 13.0统计软件进行方差分析、t检验，相关性采用Spearman法分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结    果

    2.1  24 h尿蛋白量测定结果

    模型组小鼠24 h尿蛋白总量为（7.83±0.37）mg，显著高于相应正常对照组小鼠的（1.36±0.16）mg，P＜0.01。

    2.2  肾组织p38MAPK mRNA、TGF-β1 mRNA半定量结果

    RT-PCR检测结果见图1。模型组小鼠肾组织p38MAPK、TGF-β1 mRNA表达分别与相应正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。表1  两组小鼠肾组织p38MAPK、TGF-β1 mRNA表达的半定量分析 1)与正常对照组比较，P＜0.01

    2.3  肾组织HE、Masson染色结果

    正常对照组小鼠肾小球、近端小管及远端小管的大小、形态正常。模型组小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生,系膜区增宽，大量基质沉积,可见部分肾小球呈现萎缩硬化改变;肾小管呈多灶性萎缩及空泡变性,上皮细胞胞核脱落、坏死,管腔内可见大量蛋白管型，肾间质基质沉积明显。

    2.4  免疫组化结果

    2.4.1  肾组织中TGF-β1表达变化  正常对照组小鼠仅在少数肾小管有微弱TGF-β1表达,而模型组小鼠肾小球细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和肾间质浸润的单核细胞胞浆均有TGF-β1明显表达，染色细胞数明显增多，细胞染色程度加深。见图2。

    2.4.2  肾组织中p38MAPK表达变化  正常对照组小鼠肾脏远端肾小管、近端肾小管及集合管上皮细胞均有少量p38MAPK表达；模型组小鼠肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、肾小管间质中阳性细胞数显著增加，阳性表达颜色加深。见图3。

    2.4.3  肾组织中P-p38MAPK表达变化  正常对照组小鼠仅肾小管间质有极少量的P-p38MAPK表达；模型组小鼠肾组织P-p38MAPK主要表达在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、近端和远端肾小管及集合管上皮细胞。见图4。

    2.5  Western blot检测结果

    Western blot检测结果见图5。模型组小鼠肾组织TGF-β1、p38MAPK 、P-p38MAPK蛋白表达较正常对照组小鼠明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表2。表2  两组小鼠肾组织p38MAPK、TGF-β1和P-p38MAPK蛋白表达的定量分析

    2.6  肾组织TGF-β1、p38MAPK和P-p38MAPK 相关分析

    实验小鼠肾组织p38MAPK 表达与TGF-β1 表达呈正相关(r=0.418,P＜0.05)，P-p38MAPK 表达与TGF-β1表达呈正相关(r=0.432,P＜0.05)，P-p38MAPK 表达与p38MAPK 表达呈正相关(r=0.414,P＜0.05) 。

    3  讨    论

    肾脏纤维化是几乎所有肾脏疾病到终末期肾功能衰竭的共同通路,包括LN在内许多进展性肾脏疾病均具有TGF-β1持续过度表达的特征。TGF-β1是公认的肾脏致纤维化因子之一,而MAPK通路是细胞内TGF-β1信号通路的重要成分。其亚型p38MAPK是控制炎症反应最主要的MAPK家族成员之一,其信号转导途径是近年来细胞生物学研究的热点之一。p38MAPK信号转导通路采用高度保守的三级激酶级联传递信号:细胞外刺激激活MKKK(MAP kinase kinase kinase),转而激活MKK(MAP kinase kinase),然后通过双位点磷酸化成为磷酸化p38MAPK而激活MAPK 信号转导通路,参与应激条件下细胞的凋亡、免疫调节、细胞转分化及炎症反应过程［2］。Meyer-Ter-Vehn等［3］研究表明，TGF-β1通过活化p38MAPK诱导人成纤维细胞胶原Ⅰ的合成，纤维连接蛋白(FN)、α-SMA的表达及细胞增殖,p38MAPK特异性抑制剂能抑制上述表达，说明p38MAPK在TGF-β1诱导的肌成纤维细胞转分化及细胞外基质合成中发挥重要作用。Stambe等［4］研究单侧输尿管梗阻（UUO）大鼠肾间质纤维化动物模型中p38MAPK信号通路的作用时显示，磷酸化p38MAPK在UUO大鼠肾间质成纤维细胞及肾小管上皮细胞均明显增加，而以特定p38MAPK阻断剂NPC31169处理UUO大鼠，则肾间质纤维化程度明显减轻，提示p38MAPK可能作为TGF-β1系统下游信号分子在肾间质纤维化中起作用。Li等［5］通过构建阿霉素肾病模型发现，p38MAPK和TGF-beta1/Smad2信号通路在该模型中相继出现，而p38MAPK通路抑制剂SB203580及TGF-β1Ⅰ型受体ALK5抑制剂（ALK5Ⅰ）协同作用则可以降低肌成纤维细胞的积聚以及Ⅳ型胶原和FN的表达，进而阻碍肾小球硬化和间质纤维化的进展。Niculescu等［6］对人近端肾小管上皮细胞HKC 细胞株的研究则表明，TGF-β1诱导FN的生成是依赖于p38MAPK通路而非Smad通路。以上研究表明,p38MAPK确实参与了多种肾脏病肾脏纤维化的发生发展过程,是肾脏固有细胞重要的信号转导分子。

    但是,p38MAPK信号转导途径是否与LN肾纤维化有关,目前尚未见报道。LN 为免疫复合物性肾炎,各种致病性自身抗体通过不同机制形成免疫复合物沉积于肾脏,诱发肾脏损害。cGVHD狼疮小鼠是国际公认并被广泛应用的LN小鼠模型，其临床和病理改变酷似人类Ⅳ型或Ⅴ型(WHO分型) LN,本实验我们通过构建该模型,从mRNA和蛋白质两个不同水平，观察小鼠肾组织p38MAPK和TGF-β1的表达分布及表达量的变化。结果显示,模型组小鼠24 h尿蛋白量较正常对照组明显升高,病理组织学检查发现模型组出现肾小球硬化、基质大量增生及间质纤维化，这表明我们成功构建了cGVHD LN小鼠模型。而且实验结果表明,正常对照组小鼠的肾组织p38MAPK有一定的基础表达,但其活化形式P-p38MAPK仅有极少量表达，模型组p38MAPK mRNA和蛋白表达明显增多，同时P-p38MAPK表达亦相应增加，与正常对照组相比具有显著差异。另外，模型组TGF-β1表达明显增加，且p38MAPK的表达强弱与肾组织TGF-β1的表达水平呈明显正相关。这些结果提示,p38MAPK在cGVHD狼疮样小鼠模型发病中可能起重要作用,可能介导了肾组织TGF-β1的表达,从而促进肾小球硬化及间质纤维化。对于上述结果的可能解释是：（1）活化的TGF-β受体通过激活TGF-β活化蛋白激酶1(TAK1) 和TAK1结合蛋白1 (TAB1) (相当于MAPKKK),启动p38MAPK信号通路，发挥致肾脏纤维化的生物学效应［7］；（2）TGF-β1 除激活p38MAPK通路外，还能激活Smad通路，p38MAPK与Smad 两条通路之间存在串话（cross talk）现象［8］，p38MAPK通路也可能通过与Smad通路的串话调节Smad介导的TGF-β1的生物学效应；（3）p38MAPK的激活能增强核转录因子AP-1、NF-κB等的DNA结合能力,这些转录因子激活后可通过增加FN基因的转录活性,直接诱导FN的产生，同时提高TGF-β1 mRNA的表达和Ⅰ型胶原的产生，高表达的TGF-β1维持p38MAPK后期的持续活化，引起FN的持续累积，即p38MAPK在TGF-β1诱导FN聚积过程中起着重要的调节作用；（4）p38MAPK还可通过介导细胞转分化等作用，参与肾纤维化和肾功能进行性损伤的过程。

    综上所述，p38MAPK可能作为TGF-β1系统下游信号介质，在LN的发病以及病变的进展过程中发挥重要作用。因此，抑制p38MAPK的活化及分泌有望成为阻止和延缓LN肾纤维化的一条较好途径。

【】
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