聚苯胺/金复合纳米纤维在大脑神经递质多巴胺检测中的应用
【摘要】 目的：研究聚苯胺/金（PANI/Au）复合纳米纤维修饰电极能否高灵敏、高选择检测大脑神经递质多巴胺（DA）。方法：基于PANI/Au修饰电极，电化学方法检测DA的响应电流，脉冲伏安法分析DA和抗坏血酸（AA）共存下的情况。结果：PANI/Au修饰电极可以获得DA的响应电流分别是单纯PANI修饰电极和裸电极的1.5和2.4倍，并且检测到DA和AA的峰电位相差达260 mV。结论：PANI/Au复合纳米纤维修饰电极可以提高DA的检测灵敏度和选择性。
【关键词】 复合纳米纤维 多巴胺 聚苯胺 金纳米颗粒 抗坏血酸 电化学
多巴胺（DA）是一种在人类中枢神经系统中非常重要的信息传递物质,其含量的改变可导致一些重要的疾病，如帕金森症和精神分裂症。因此,其测定方法的研究对探讨其生理机制和诊断相关疾病具有重要意义[1]。目前测定DA的主要方法有光度法、化学发光法、高效液相色谱法和电化学法等。其中电化学方法具有制备简便、容易操作等优点，且修饰电极的采用可增大DA传质速率,提高测定的灵敏度[2?3]。但是一般情况下，DA是和抗坏血酸（AA）共存于大脑和体液中,在固体电极上DA与AA的氧化电位相近而容易产生相互干扰, 因此获得高灵敏的DA信号并具有抗AA干扰的方法是神经专家和化学工作者一直关注的热点之一。
近年来，修饰电极朝着纳米修饰电极的方向。这主要是由于纳米材料修饰电极相对于块体电极具有传质性能高、催化活性强、有效表面积高、电极微环境的可控性好等优点[4]。众多纳米材料中，作为一种重要的有机聚合物，聚苯胺（PANI）因其具有较高的电导率、原料便宜、稳定性好而成为目前最有希望获得实际应用的导电纳米聚合物[5]。而另外一种无机材料—金（Au）纳米颗粒因具有独特的电学、光学、生物相容性、催化等特性而备受关注，在电化学分析检测方面，Au纳米颗粒已被广泛应用于电化学信号的放大[6]。随着纳米材料的发展，复合纳米材料因其将很多功能复合于一体、具有更深远的应用前景而受到广泛关注[7?8]。Yin等[9]制备的PANI和多壁碳纳米管复合物修饰电极可以实现AA存在下DA的分析测定，其中检测到的AA和DA的峰电位之差为192 mV。而目前，制备灵敏、可靠、稳定的DA传感器，寻找新型结构的纳米材料和简易方法来制备修饰电极仍是非常重要的研究课题。本实验主要用相对简单的方法制备了PANI /Au复合纳米纤维修饰电极，用其进行DA的电化学检测，并通过AA的干扰分析该方法的选择性。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
透射显微镜（JEOL JEM?2000EX），JL2180型超声清洗器，CHI 660电化学工作站(上海辰华公司产品)，电化学实验采用三电极系统:玻碳电极(直径3 mm，GCE)或纳米材料修饰玻碳电极为工作电极, 铂丝作为对电极, 饱和甘汞电极（SCE）作为参比电极。DA为Fluka产品，聚苯胺(PANI)、硫酸（H2SO4 , 98%）、过硫酸铵（APS）、甲苯、柠檬酸三钠、氯Au酸（HAuCl4）和AA购自上海化学试剂有限公司。磷酸盐缓冲液（PBS, 0.1 mol·L-1）作为实验用电解质。所有试剂为分析纯，实验用水均为高纯水。
1.2 PANI /Au复合纳米纤维修饰电极的制备
PANI是通过典型的界面反应聚合反应制备的[10]。Au溶胶是通过经典的柠檬酸还原氯金酸的方法制得的[11]。将PANI加入到Au溶胶中并搅拌8 h，由于Au纳米颗粒表面的柠檬酸根是负电性的，而PANI质子化后显示正电性，所以Au纳米颗粒很容易静电吸附到PANI的表面，从而形成复合的纳米纤维。将该产物离心并真空干燥备用。用0.05 μm 的三氧化二铝粉末在麂皮上将玻碳电极打磨、抛光至镜面，然后依次在乙醇和水中超声清洗1 min。取5 μl的1 mg·ml-1 PANI和PANI/Au胶体溶液（均按PANI的量浓度）滴涂于预处理好的玻碳电极上，空气中干燥以备用。
1.3 检测步骤及设置
首先将修饰好的电极在电解液中浸泡15 min，以保证溶液扩散于修饰电极的内层，有助于更好地进行离子交换。选取-0.4～0.8 V的电压范围进行循环伏安扫描。脉冲伏安法（DPV）扫描是采用50 mV的振幅，50 ms的脉冲宽度，脉冲间隔为0.2 s。整个电化学实验在20 ml 0.1 mol·L-1 PBS的环境下进行。
2 结 果
2.1 PANI/Au复合纳米纤维的表征
图1是PANI/Au复合纳米纤维的TEM图，从图中可以看出Au纳米颗粒附着于PANI纳米纤维的表面。Au纳米颗粒的尺寸分布较均匀，粒径约10 nm；PANI纳米纤维的平均直径为70 nm。
图1 PANI/Au复合纳米纤维的TEM图
Fig 1 TEM image of PANI/Au composite nanofibers
2.2 PANI/Au复合纳米纤维修饰电极的电化学行为
导电聚苯胺在碱性和中性水溶液中会发生脱质子化而脱掺杂,从而失去电化学活性,因此,导电聚苯胺的电化学性质一般是在酸性水溶液中进行研究。实验中我们对比了pH 2.0、3.0、4.0酸度下PANI/Au修饰电极的电化学行为（图2）。从图中可以看出pH 2.0时PANI/Au展示的是两对分散开的氧化还原峰，分别对应着苯胺和聚苯胺间转换时的两种中间产物[12]；当pH增加至3.0时这两对氧化还原峰向中间电位靠拢，表现出一对比较宽的氧化还原峰；当增加至4.0时，该宽峰进一步变窄。以下的实验即是在pH 4.0的情况下进行的，这样的选择是为了尽量避免PANI的氧化还原峰对DA峰的干扰。
图2 PANI/Au复合纳米纤维修饰电极在pH 2.0、3.0、4.0 PBS溶液中的循环伏安图（扫速为20 mV·s-1）
Fig 2 Cyclic voltammograms of PANI/Au?modified GCE measured in pH 2.0，3.0，4.0 PBS at a scan rate of 20 mV·s-1
2.3 PANI/Au复合纳米修饰电极对DA的电催化响应 DA的电化学氧化是一步两电子两质子的过程。图3展示了裸电极、单纯PANI修饰电极、PANI/Au修饰电极下8 mmol·L-1 DA的电化学循环伏安图。在600 mV附近出现的峰为DA氧化为醌型结构时产生的[13]，同时也观察到PANI的氧化峰。通过对比发现3种电极下获得的DA峰电流有所不同：PANI/Au修饰电极下DA的电流峰值为1.25×10-4A，而在PANI修饰电极下相应电流为8.15×10-5A，裸电极的为5.12×10-5A。即PANI/Au修饰电极获得DA的电流值是单纯PANI修饰电极的1.5倍，是裸电极的2.4倍。图4是不同DA浓度下，各电极检测到的响应电流值，其对比结果也可看出复合纳米材料修饰的电极可以获得更高的DA峰电流。
a. 裸电极；b. PANI纳米纤维修饰电极；c. PANI/Au复合纳米纤维修饰电极
图3 在8 mmol·L-1DA溶液中的循环伏安图（扫速20 mV·s-1）
Fig 3 Cyclic voltammograms of, bare GCE(a), PANI?modified GCE (b)and PANI/Au?modified GCE (c) in 8 mmol·L-1 DA solution at a scan rate 20 mV·s-1
图4 3种电极对不同浓度DA下的循环伏安阳极峰电流值的对比图
Fig 4 The comparison of anodic current of DA in different concentrations (0,1,2,4,8 mmol·L-1 ) at the three kinds of electrode
为了进一步阐述Au纳米颗粒在DA电催化检测中的作用，对其不同尺寸进行了对比（图5）。在实验中主要是比较了10、30和50 nm 3种尺寸的Au纳米颗粒。取相同质量的这3种材料，发现其对DA的催化活性顺序是10 nm＞30 nm＞50 nm，即随着金纳米颗粒的粒径减小催化活性增大。
图5 不同尺寸Au纳米颗粒负载于PANI纳米纤维修饰电极对8 mmol·L-1 DA检测的循环伏安图（20 mV·s-1）Fig 5 Cyclic voltammograms of DA at PANI/Au composite with different sizes of Au NPs modified GCE at a scan rate 20 mV·s-12.4 AA的干扰
图6A是裸电极对AA和DA共存体系的DPV图，从图中可以看出两者的峰电位很接近，所以不可能利用裸电极来检测含有AA的DA样品液。用PANI纳米纤维修饰电极可以解决这一问题。如图6B所示的该修饰电极下共存体系的DPV图，DA的氧化峰和AA的发生了分离，出现在更负的电位。另一方面，AA的氧化峰电位也由原来裸电极下的0.5 V负移至0.25 V，与PANI的氧化峰（约0.1 V）产生部分重叠。当用PANI/Au复合纳米纤维修饰电极对DA和AA的共存体系进行DPV分析时（图6C），发现不仅获得了更高的DA峰电流， 而且PANI、DA和AA三者的峰彼此分离，检测到的DA和AA的氧化峰电位差达260 mV。
2.5 DA的定量分析
DPV是常用的定量分析方法，图7是PANI/Au修饰电极在不同浓度DA下的DPV图。可以看出PANI的峰电位比DA的低380 mV，完全不会干扰DA的检测。在选定条件下,DA在电极上响应峰电流随浓度增大而增大,而峰电位基本不变。在5.0×106～8.0×103 mol·L-1范围内DA阳极峰电流与其浓度具有良好的线性关系, 线性相关系数为0.995 7 ,检出限为8.0×107mol·L-1。
2.6 PANI/Au修饰电极的稳定性
对电极的稳定性和实验结果的可重复性进行测试发现，该修饰电极在1 mmol·L-1 DA溶液中连续循环伏安扫描50圈，得到的检测结果是首次扫描峰电流的98%，然后放回PBS缓冲液中浸泡12 h进行扫描，没有发现DA的电流峰。实验用3个玻碳电极进行同样的操作，得到一致的结果。
3 讨 论
DA是脑功能的物质基础,其代谢障碍会引起其含量变化,从而导致某些疾病的发生。因此,对于其测定方法的研究,无论在神经生研究方面,还是疾病诊断及相关药物的质量控制方面都具有实际意义[14] 。但是,在样品中通常同时存在AA 会严重干扰DA 的测量,如何克服AA 的干扰,成为研究的重要目标。电化学分析是DA的重要研究方法之一。利用普通的电极测定DA时,通常排除不了AA 的干扰。为此,人们研究了很多种材料进行修饰电极来提高DA检测的灵敏度和选择性。纳米材料的为电化学分析提供了无限的想象空间，但是纳米材料的多功能、制备组装方法的简易性以及分析的方便和灵敏性仍然是需要考虑的重要问题。
本实验的研究提供了一种电化学分析检测DA的简易方法。主要是基于PANI/Au复合纳米纤维修饰电极，不仅获得了高出普通裸电极2.4倍的灵敏度，还可以将DA和AA的响应电位分离达260 mV。与裸电极相比，单纯用PANI修饰电极所展示的电催化效应主要是基于PANI纳米纤维具有高的电导性和大的比表面积。当PANI纳米纤维负载上Au纳米颗粒后，所获得的DA峰电流进一步增加，这主要是因为电导性好的Au纳米颗粒不仅可以为DA的电化学反应过程提供活性位点，而且还促进PANI与电极的电接触，起到传递的媒介作用。而随着Au纳米颗粒粒径的减小,其表面光滑程度变差,形成了凸凹不平的原子台阶,这有利于增加分子反应的接触面,从而提高催化剂的活性；另外Au纳米颗粒尺寸的减小，产生的活性位点会增多，增强了电子传导从而促使产生更高的DA响应电流。
另外，PANI/Au修饰电极可以实现DA和AA的分离检测，并且PANI的电流峰并没有干扰到DA和AA中的任一响应峰。这主要是因为在酸性条件下，PANI发生了质子化[15]，与电正性的DA相互静电排斥，与电负性的AA产生静电吸引。但用单纯的PANI修饰电极，产生的AA氧化峰会和PANI本身的峰部分重叠。负电性的Au纳米颗粒的加入降低了PANI纳米纤维与AA的静电吸引力，使得到的3个峰彼此分离。因此，PANI/Au复合纳米纤维修饰电极在分析检测DA样品方面更有前途，有望实现DA和AA的同时检测。该复合纳米纤维修饰电极稳定，对其它的生物医药分析检测也有较广阔的应用前景。
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