小鼠Lewis肺癌胸腔移植模型的建立

【摘要】  目的：　通过胸腔移植的方法建立晚期肺癌的动物模型。方法：　经C57BL/6小鼠的腋后线第6肋间胸腔(胸腔模型组)或小鼠腋部皮下(皮下模型组)分别移植鼠源性Lewis肺癌细胞0.2ml （5×106ml-1），观察小鼠的生存时间、小鼠体重、饲料消耗量、游泳试验、常压耐缺氧试验，大体观察胸腔、纵隔、胸水等肺癌细胞浸润和转移情况。结果：　胸腔模型组小鼠中位数生存时间13.5（8～18）d，皮下模型组小鼠中位数生存时间45（25～71）d，胸腔模型组的生存期范围离散程度较皮下模型组小（Ｐ<0.05）。病程中胸腔模型组小鼠体重下降、摄食减少等恶病质体征较皮下模型组明显（Ｐ<0.01），胸腔模型组小鼠活动减少、睡眠时间缩短、蜷曲、毛发脱落等现象较皮下模型组多见，胸腔模型组小鼠游泳实验及耐缺氧实验时间较皮下模型组明显缩短（Ｐ<0.01），胸腔模型组小鼠早期可出现胸水和肿瘤转移，而皮下模型组小鼠早期未见胸水和肿瘤转移。结论： 胸腔移植模型可作为晚期肺癌动物模型。

【关键词】  Lewis肺癌 胸腔移植模型 皮下移植模型 晚期肺癌 小鼠

    肺癌动物模型与临床结果一直存在差距，尤以晚期模型更为明显。我们在进行动物实验研究中发现，目前使用的肿瘤皮下移植模型中，动物生存时间差异很大，不利于生存期观察。肿瘤到晚期也可以出现转移，但是发生率很不一致。另外，模型的肿瘤负荷和产生的症状、并发症、生存状态也很不一致。为了克服皮下移植模型缺陷，有学者采用将人类癌组织或肿瘤细胞悬液直接植入支气管的方法，可以很好模拟支气管肺癌的临床特征，但是其技术要求较高，成功率较低［1?2］。另外，也有人采用外科手术移植方法，同样也是成功率低于10%［3］。这些模型都需要无胸腺裸鼠或SCID小鼠，饲养条件高，实验费用昂贵。鉴于肺癌模型的建立现状，至今未见有经胸腔直接移植建立晚期肺癌模型的报道，因此，作者采用清洁级小鼠C57BL/6胸腔种植鼠源性Lewis肺癌细胞的方法，进一步比较该模型和皮下移植模型肿瘤生长状况，观察前后小鼠生存时间、生存状态及其相互关系，研究该模型稳定性和实用性。

    1  材料与方法

    1.1  细胞株

    鼠源性Lewis肺癌细胞系由院上海细胞库提供，在含10%胎牛血清及双抗（青霉素100IU·ml-1，链霉素100IU·ml-1）的DMEM (GIBCO 公司产品) 完全培养液中培养，条件是37℃、5%CO2，2～3d更换1次培养液。细胞总数达到要求时用2.5%胰酶消化。消化前2h新鲜培养液换液1次，消化后再用新鲜培养液洗1次，台盼蓝拒染法测定活细胞数大于95％，调节细胞浓度为5×106ml-1 细胞悬液备用。

    1.2  动物

    有C57BL/6遗传背景的小鼠由徐州医学院实验动物中心提供并饲养于SPF级环境，室温(25±2)℃，给予无菌全价营养颗粒饲料及无菌水。本研究选用的小鼠为6～8周龄的雄鼠200只， 体重平均(18±1) g。

    1.3  方法 

    200只小鼠随机分为胸腔模型组和皮下模型组，每组100只，将制作好的Ｌewis肺癌单细胞悬液，在每只小鼠腋后线第6肋间胸腔或腋部皮下接种0.2ml（5×106 ml-1）。

    1.4  生存指标检测

    1.4.1  生存期  造模至小鼠死亡的时间。

    1.4.2  体重  在每日20:00～21:00时用称测量每只小鼠的体重，精确到1/100g，资料存入EXCEL备检验。

    1.4.3  饲料消耗量  在每日20:00～21:00时定量给予小鼠饲喂无菌全价营养颗粒饲料，24h测量盒内剩余的饲料量，小鼠的饲料消耗量，精确到1/100g。

    饲料摄取量=前日饲料重量－次日测得饲料重量。

    1.4.4  小鼠游泳实验  在每组造模后第14天，令各组动物在水温(17±1)℃下游泳，用相当于小鼠体重10%的橡皮泥在每只小鼠尾部负重，分别放入玻璃缸内游泳并计时，注意观察当小鼠头部沉入水中10s不能浮出水面者即为体力耗竭，即刻计时，为小鼠游泳时间，比较各组小鼠因游泳致疲劳而死亡的时间。

    1.4.5  小鼠常压耐缺氧实验  每组造模后第14天，各组的小鼠分别放入装有25g钠石灰的容积为250ml的广口瓶内（每瓶置放1只小鼠），用凡士林涂抹瓶口，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间，比较各组常压下的耐缺氧时间。

    1.4.6  大体观察  观察胸腔模型组小鼠胸腔、纵隔、心包、胸水等肺癌细胞浸润和转移情况。

    1.5  数据处理

    用SPSS 11.5软件包处理，数据以x±s表示，组内差异采用方差分析（ANOVA），组间差异采用t检验，生存期取中位数并绘制生存曲线，Ｐ<0.05为统计学差异有显著性。

    2   结    果

    2.1  小鼠生存期观察

    胸腔模型组中位数生存时间13.5（8～18）d，皮下模型组中位数生存时间45（25～71）d。胸腔模型组的生存期范围离散程度较皮下模型组小（Ｐ<0.05）。

    2.2  小鼠生存状态观察 

    胸腔模型组小鼠体重下降、摄食减少等恶病质状态较皮下模型组明显，病程中胸腔模型组小鼠活动减少、睡眠时间缩短、蜷曲、毛发脱落等症状较皮下模型组多见（图1、2）。

    2.2.1  体重  平均体重胸腔模型组小鼠为（12.19±4.69）g，皮下模型组小鼠为（19.40±1.10）g，胸腔模型组较相应皮下模型组体重下降明显（Ｐ<0.01）。

    2.2.2  饲料消耗  饲料平均消耗量胸腔模型组小鼠为（1.67±1.01）g，皮下模型组为(3.16±0.11) g，胸腔模型组与相应皮下模型组相比下降明显（Ｐ<0.01）。

    2.2.3  耐缺氧实验及游泳实验  平均游泳时间胸腔模型组为(12.67±3.27) s，皮下模型组为(80.33±9.56) s，两组比较差异有统计学意义(Ｐ<0.001)。平均耐缺氧时间胸腔模型组为(42.50±5.61)min，皮下模型组为(96.50±23.57)min，两组比较差异有统计学意义（Ｐ<0.005）。

    2.2.4  大体观察  胸腔模型组小鼠出现胸水和肿瘤转移，如纵隔、心包和肝转移等（图3～6）。皮下模型组未见肿瘤转移。

    3  讨    论

    小鼠的肺肿瘤在组织发生、临床过程和组织形态学上都与人类肺癌有相似之处。特别是应用近交系小鼠，便于实验设计，使动物实验结果准确、均一、、重复性强，但直到目前，仍没有令人满意的能充分代表晚期肺癌临床生物学特征的动物肺癌模型出现。

    目前常用的小鼠肺癌动物模型有：（1）将肺癌细胞接种于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。此方法简单易行，但皮下生长的肺癌与临床在肺部生长的肺癌生物学特性有很大不同，所以，应用此模型得到的实验结果与临床应用的实际效果之间常有比较大的差异。（2）将小鼠的气管分离，经过反复冻融处理，然后将肺癌细胞接种到气管，结扎气管两端后，再将气管移植到重度复合免疫缺陷小鼠的皮下［4］。此方法虽然将肺癌细胞接种到气管组织内，但方法较复杂，且需要将离体的气管移植到其他小鼠皮下，肺癌细胞生长的生物特性也会改变。（3）切开胸壁皮肤， 将肺癌细胞或肺癌组织直接种植到肺内［5?6］。此方法有一定的创伤性和死亡率，肺癌细胞生长在肺实质内，但只能使70%～90%的接种小鼠产生肿瘤，对进行进一步的肺癌研究造成一定的影响。（4）将肺癌细胞直接注入重度复合免疫缺陷型小鼠的气管以建立细支气管内的肺癌模型［7］，此方法也未能建立理想的肺癌模型，究其原因可能是由于气道假复层柱状纤毛上皮的作用，将注入的细胞排出体外，一部分细胞可通过移植孔在气管前形成肿瘤灶，使肺癌细胞难以在细支气管内停留，也难以进入肺泡，故难以在肺脏内生长。

    鉴于至今未见有经胸腔直接移植建立晚期肺癌模型的现状，我们尝试将Lewis 肺癌细胞接种于清洁级C57BL/6近交系小鼠胸腔及皮下制备肺癌肿瘤模型，系统地研究了小鼠存活时间、生存状态。对肺癌模型进行可行性和实用性研究，为晚期肺癌的研究探寻较理想的实验工具。

    实验结果表明，胸腔模型组中位数生存时间13.5d，皮下模型组中位数生存时间45d。胸腔模型组的生存期范围离散程度较皮下模型组小，较小的离散范围使我们便于观察，保证了模型的均一性，减少了实验误差。胸腔模型组小鼠体重下降、摄食减少等恶病质状态较皮下模型组严重，病程中胸腔模型组小鼠活动减少、睡眠减少、蜷曲、毛发脱落等症状较皮下模型组多见。胸腔模型各组病程中体重和摄食下降较对应皮下模型组明显，游泳及耐缺氧实验时间较对应皮下模型组明显缩短，而皮下模型组内小鼠各项生活状态检测指标变化不明显。另外，胸腔模型组小鼠可出现肿瘤转移，而皮下模型组很少有转移的情况。从以上结果可以看出，胸腔移植模型较皮下移植模型能更好模拟晚期肺癌的表现，这体现了胸腔移植模型的实用性和稳定性。因此从本研究我们得出如下结论：胸腔移植模型可作为晚期肺癌的动物模型，可用来评价癌症效果，进行治疗方案选择，或者评价药物的效果及副作用，并可用于抗癌药物的筛选，这也是我们进一步研究的方向。

    另外在造模中应注意以下几点：（1）胸腔穿刺要轻、快，以免引起气胸导致动物死亡；（2）胸腔穿刺要注意深度，以免刺破心脏、肺或大血管引起动物死亡；（3）本研究选用的是Lewis肺癌细胞株，而非瘤株，这是由于通过瘤株制备的瘤细胞悬液在研磨时会破坏肿瘤细胞的完整性，悬液中还存在许多结缔组织，不仅可能堵塞移植针头，而且还可能使细胞计数不准确，造成造模不均的问题。

【】
  ［1］ASTOUL P, WANG X, HOFFMAN R M. “Patient?like” nude?, and SCID?mouse models of human lung and pleural cancer[J]. Int J Oncol, 1993, 3:713?718.

［2］MCLEMORE T L, LIU M C, BLACKER P C, et al. Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice[J]. Cancer Res, 1987,47: 5132?5140.

［3］HAMIDE J P, QIAN Z, XU H, et al. Percutaneous implantation of non?small?cell lung carcinoma: technique and observations[J]. Acad Radiol, 1997, 4: 629?633.

［4］CHEE J J, PECK K, HONG T M, et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model[J]. Cancer Res, 2001, 61 (13):5223?5230.

［5］JOHNSTON M R, MULLEN J B, PAGURA M E, et al. Validation of an orthotopic model of human lung cancer with reginal and system icmetastases[J]. Ann Thorac Surg, 2001, 71 (4):1120?1125.

［6］YAMAURA T, DOKI Y, MURAKAMI K, et al. Model for mediastinallymph node metastasis produced by orthotopic in traulmonaryimp lantation of lung cancer cells in mice[J]. Human Cell, 1999, 12 (4):197?204.

［7］张贺龙, 矢野圣二, 三木丰和, 等. 经气管接种肺癌细胞建立肺癌动物模型的经验教训[J].第四军医大学学报, 2002, 23(17):1586.