溶酶体cathepsin B参与大黄素诱导HK?2细胞凋亡

           作者：王翠芬，陈敏，吴旭东，孙立新，严明，张陆勇 

【摘要】  目的：研究大黄素对人肾小管上皮HK?2细胞的细胞毒性及其机制。方法：用MTT法检测经0～100 μmol·L-1浓度大黄素作用后HK?2细胞的活力，透射电镜观察细胞核形态的改变，流式细胞仪检测亚二倍体细胞比例，用特异性的底物分别测定caspase 3和cathepsin B的活性。结果：大黄素可引起HK?2细胞死亡，并伴有亚二倍体细胞比例的增加和核浓缩、染色体边集等形态的改变，在引起HK?2细胞凋亡的浓度下caspase 3活性增加，而用caspase 3特异性抑制剂Ac?DEVD?CHO可抑制上述改变。在诱导HK?2细胞凋亡的剂量下大黄素使cathepsin B表达及其活性升高，cathepsin B特异性抑制剂CA?074能拮抗大黄素诱导的caspase 3活性升高,恢复HK?2的细胞活力。结论：大黄素在体外主要以caspase 3 依赖方式引起HK?2细胞凋亡，cathepsin B参与了此过程。

【关键词】  大黄素; HK?2细胞; 凋亡; caspase 3; cathepsin B

    大黄素（emodin）为蒽醌类化合物，具有导泻、调节免疫、抗菌抗炎、抗病毒、抗肿瘤等作用。1996年Marchant报道大黄素具有肾毒性；2001年美国NTP报道，大黄素可引起实验动物（大鼠和小鼠）肾小管细胞玻璃样变、色素沉着，增加雌性小鼠肾病发生率。我们以往的实验也证实中药大黄对肾脏有损害，并已有初步证据表明，大黄素作为大黄的主要生物活性成分之一起着主要作用，但其损害机制还不清楚。本实验首先在体外观察大黄素对来源于人肾小管上皮细胞的HK?2细胞的直接作用，并探讨大黄素引起HK?2凋亡的主要途径和可能机制。

    1  材料和方法

    1.1  细胞培养及相关试剂

    HK?2细胞购自ATCC,置于含10%胎牛血清的DF12(DMEM∶F12=1∶1)培养基中，在37 ℃、5%CO2孵育箱中培养。大黄素购自江苏省药品检验所。caspase 3的显色底物Ac?DEVD?pNA、caspase 3特异性抑制剂Ac?DEVD?CHO、cathepsin B的荧光底物Z?Arg?Arg?7?amido?4?methyl?coumarin hydrochloride、特异性抑制剂CA?074［N?(1?3?trans?propyl?carbam oyloxirane?2?carbonyl)?1?isoleucyl?1?proline］均购自Sigma。抗人cathepsin B抗体及二抗均购自Upstate Biotechnology。

    1.2  MTT法测定细胞活力

    取对数生长期HK?2细胞,以5×104终浓度接种于96孔培养板,加入不同浓度(0～100 μmol·L－1)大黄素,作用一定时间后每孔加入20 μl MTT，再孵育4 h。在酶标仪570 nm波长处读取吸光度(A)值。每样本重复3个孔,每个实验重复3次,取平均值。

    1.3  透射电镜观察细胞核的形态改变

    分别用不同浓度大黄素处理细胞后，固定，脱水，包埋，最后制成超薄切片，在透射电镜(JEM 2000)下观察并照相。

    1.4  流式细胞仪检测

    PI单染：细胞经大黄素处理后分别收集(106 ml－1)，用预冰冷的PBS洗2遍，在-20 ℃用70%的乙醇固定至少1 h，弃去固定液后再洗2遍，0.5 ml PI染液染色，4 ℃避光10 min，上流式细胞仪检测，分析亚二倍体细胞比例。

    Annexin Ⅴ/PI 双染：HK?2细胞经不同处理后收集(106 ml－1)，与Annexin Ⅴ/PI 试剂避光孵育30 min，上流式细胞仪检测，分析早期和晚期凋亡细胞比例。

    1.5  caspase 3活性测定

    收集处理过的细胞 1×106，PBS洗涤，制备细胞裂解液加 Ac?DEVD?pNA（caspase 3四肽显色底物），37 ℃反应 2 h。用酶标仪405 nm波长处读取A值。

    1.6  Western blotting

    细胞经不同浓度大黄素处理后，加入适量细胞裂解液裂解细胞，收集于1.5 ml的离心管中，以12 000 r·min-1  4 ℃ 离心20 min。取上清，用Bradford法测定蛋白含量，每种样品各取蛋白50 μg上样，SDS?PAGE电泳，电转移至醋酸纤维膜上，BSA封闭，依次滴加一抗（1∶1 000）及二抗（1∶3 000），室温下孵育后洗膜显像。

    1.7  cathepsin B活性测定

    收集处理过的细胞1×106，PBS洗涤，制备细胞裂解液加cathepsin B的荧光底物37 ℃反应15 min,多功能酶标仪读取荧光值。

    1.8  统计学处理

    采用SPSS 10.0统计软件分析。常规进行方差齐性检验、正态性检验,计量资料以x-±s表示。单变量两组资料之间的比较采用t检验,多组资料之间的比

    较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性。

    2  结    果

    2.1  大黄素诱导HK?2细胞产生凋亡

    MTT结果显示，40 μmol·L－1大黄素可明显抑制HK?2细胞的活力（图1A）。正常HK?2细胞核呈均一着色，经40 μmol·L－1大黄素处理24 h后的HK?2细胞细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染（图1B）。用PI单染细胞DNA，观察基因组DNA的变化，发现用大黄素处理的HK?2细胞亚二倍体细胞比例增加（图1C）。核浓缩、染色体边集、亚二倍体细胞比例增加是细胞发生凋亡时特有的表现。这些结果表明，在本实验剂量和时间范围内大黄素对HK?2细胞毒作用主要是通过诱导细胞凋亡而产生的。

    2.2  大黄素依赖caspase 3诱导HK?2细胞产生凋亡

    用不同浓度大黄素与HK?2细胞分别作用24 h后，再用caspase 3特异性底物Ac?DEVD?pNA测定大黄素对HK?2细胞caspase 3蛋白酶的活性。结果（图2A）表明，大黄素使HK?2细胞的caspase 3活性浓度依赖性升高。用caspase 3特异性抑制剂Ac?DEVD?CHO 200 μmol·L－1，2 h后再加大黄素40 μmol·L－1作用24 h，结果显示细胞活力恢复（图2B），大黄素诱导的亚二倍体细胞比例下降（图2C）。上述结果提示大黄素主要依赖于caspase 3诱导HK?2细胞产生凋亡。A.大黄素激活了caspase 3酶活性，且具有浓度依赖性（与对照比较,*P＜0.05,**P＜0.01）；

    2.3  溶酶体途径参与大黄素诱导的HK?2细胞凋亡

    用不同浓度大黄素处理HK?2细胞24 h后，再采用Western blot分析cathepsin B的蛋白表达水平，40 μmol·L－1大黄素使HK?2细胞cathepsin B表达明显升高（图3A）。用cathepsin B的特异性荧光底物检测大黄素对cathepsin B活性的影响，显示大黄素显著提高了cathepsin B的活性（图3B）。用cathepsin B特异性抑制剂CA?074和大黄素共处理HK?2细胞，结果发现大黄素诱导的caspase 3活性明显被抑制（图3C）,同时细胞活力也部分恢复（图3D）。这些结果表明大黄素增加了HK?2细胞cathepsin B的表达及其活性，大黄素所诱导的HK?2细胞凋亡与cathepsin B有关。

    3  讨    论

    大黄(radix rhizoma rhei)为常用中药，具有泻下、抗菌、抗肿瘤、抗高血脂症等作用［1?2］。大黄素的化学名称是3?甲基?1,3,8?三羟基蒽醌，是大黄总蒽醌中的一个主要成分［3?4］。动物亚急性毒性实验和长期毒性实验结果显示，大黄素可导致大鼠肾小管出现病理性改变。我们以人肾小管上皮细胞 HK?2为对象，研究大黄素对其的直接毒性作用及可能的机制。本实验首次检测了大黄素对HK?2细胞的毒性作用，结果表明大黄素在该实验条件下可抑制HK?2细胞生长，出现核浓缩、染色体边集现象，同时亚二倍体细胞比例升高，caspase 3及溶酶体 cathepsin B活性增强。A.大黄素诱导cathepsin B表达升高； B.大黄素诱导cathepsin B活性增强（与对照比较，*P＜0.05,**P＜0.01）； 凋亡（apoptosis）是一种伴有染色体浓缩、凋亡小体出现等特征性改变的细胞死亡［5］。机体内外环境的改变以及各种病理刺激因素均可诱导细胞凋亡。细胞在凋亡过程中，DNA被裂解成小的片段，用流式细胞仪分析细胞DNA出现SubG1峰即凋亡峰［6］，镜下出现核浓缩、核碎裂、核边集等现象。本实验结果充分说明，在实验剂量下大黄素可诱导HK?2细胞凋亡。

    caspase家族是一大类凋亡调节蛋白酶，其中caspase 3是介导细胞凋亡的关键效应酶，是凋亡执行的重要效应分子。在正常情况下，caspase 3以无活性的酶原形式存在于哺乳动物的组织和细胞内。不同的蛋白酶切割caspase 3酶原，激活caspase 3，活化的caspase 3进一步又切割不同的底物，导致蛋白酶的级联切割放大，最终使细胞走向死亡。本实验结果表明，大黄素使HK?2细胞的caspase 3活性增强，进一步说明大黄素可诱导HK?2细胞产生凋亡。用caspase 3特异性抑制剂Ac?DEVD?CHO预处理，则可拮抗大黄素引起的HK?2细胞凋亡，此结果提示大黄素诱导的HK?2细胞凋亡依赖于caspase 3途径。

    目前研究发现，在生理和病理情况下引起凋亡的途径有坏死受体途径、线粒体途径等几种［7］。cathepsin B属于木瓜蛋白酶家族中的半胱氨酸蛋白水解酶，广泛分布于各种组织细胞的溶酶体中，主要降解各种组织蛋白。新近研究发现，cathepsin B不但参与细胞内物质降解，还与细胞凋亡有关。cathepsin B通过裂解Bid，引起线粒体释放细胞色素C，从而导致细胞凋亡的瀑布效应［8?9］。在正常状态下cathepsin B以酶原形式储存于溶酶体中，相对分子质量38，一旦释放至胞浆，可被溶酶体中其他蛋白水解酶水解或自身激活形成相对分子质量27的活性形式。本实验结果发现，大黄素使cathepsin B活性形式增多、cathepsin B活性增强，提示cathepsin B可能与大黄素诱导的HK?2细胞凋亡有关。用cathepsin B特异性抑制剂AC?047抑制cathepsin B的活性，结果发现大黄素介导的caspase 3的活化被拮抗，细胞活力恢复，提示cathepsin B参与了大黄素诱导的HK?2细胞凋亡，但其通过何种信号通路所介导，有待进一步研究。

【】
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