酒精性肝纤维化中Smad4的表达情况研究
作者:吴凌康 王小奇 任自立 叶 尉
摘要：目的 为了探讨Smad4在酒精性肝病肝组织中的表达和分布情况，揭示酒精性肝病的部分发病机制。方法 采用肝纤维化Masson染色考察酒精肝纤维化程度，用免疫组化考察Smad4分子在酒精性肝病肝组织中的表达，用RT-PCR方法考察Smad4在核酸水平的表达和分布情况。结果 正常肝组织和酒精肝早期，Smad4表达为阴性，酒精肝纤维化阶段Smad4表达显著阳性，主要分布在汇管区，壁周隙，纤维间隔等非实质细胞，进一步以PCR方法考察，发现正常组和酒精肝晚期组相比较，其Smad4的表达量有显著差异。结论 Smad4参与了酒精性肝纤维化。
[关键词] 酒精性肝病； 肝纤维化； Smad4； TGF-beta
[Abstract] Objective To investigate the expression and role of Smad4 in ALD. Methods imumnohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction was used . Results There is no expression of Smad4 in normal liver and liver of earlier period ALD. Smad4 significantly increase in liver of late period ALD. They mainly distributed in portal area, perisinusoidal space and fibrous septa. Conclusion : Smad4 might be a important factor of fibrogenesis in late period of Alcoholic Liver Disease .
[Key words] Alcoholic Liver Diseas Smad4 liver fabrosis TGF-beta
近年来随着酒精消耗量的增加，酒精性肝病的发病率呈上升的趋势，酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化肝硬化，该病的发病机制尚不明了，但肝纤维化无疑是该病后期的一个重要的病理改变。已有研究表明TGF-beta是肝纤维化的一个极重要的启动因子，而在TGF-beta下游存在一个复杂的Smads信息传导，Smad4是其中一个重要的信号分子，为了探察，Smad4是否参与酒精性肝病的发生，本实验以酒精灌胃制作大鼠酒精肝模型，以免疫组织化学和RT-PCR的方法考察了酒精肝组织中Smad4的表达和分布情况。
材料与方法
1、 实验动物 采用健康，性成熟，一级质量标准的S-D大鼠34只，雌雄各半，体重180-210g，分笼喂养。大鼠由浙大医学院动物中心提供。
2、 主要试剂:苏木素染料，丽春红染料，亮绿染料，兔抗大鼠Smad4多抗（一抗），辣根过氧化酶标记羊抗兔多抗（二抗），Trizol试剂，M-MLV逆转录酶，Tag酶，10mM/LdNTP
PCR仪等。
3、 酒精肝模型 以上实验动物在浙大医学院动物中心以清洁二级喂养，随机分为两组，均为雌雄各半，白酒灌胃24只，三个月后处死10只取得肝脏标本，部分浸泡于10%福尔马林中留于病理检查，部分置于液氮中再保存于-80度冰箱中用于RT-PCR。六个月后再处死另一批11只老鼠处理同前。实验过程中死亡3只，原因不明。另10只免白酒灌胃，以等量生理盐水灌胃，6个月后全部处死，标本处理如上。因此大鼠肝脏标本分为：A组10只 正常对照组织；B组10只 酒精灌胃3个月组；C组10只 酒精灌胃六个月组。
4肝组织Masson染色观察 切片脱蜡脱水后苏木酸染色8分钟酒精分化水洗，1%丽春红酸性品红染色8分钟，水洗后1%磷钼酸染色6分钟，0.2%亮绿 5分钟，水洗，封片。
5、 免疫组织化学检测 用invision法，探测各组模型肝组织中Smad4的分布和表达强度，阳性对照由武汉博士德公司提供，另以动物羊血清代替一抗制作阴性对照，结果判定：镜下组织切片出现棕黄色染色则判为为阳性片。
6、 RT-PCR检测 （1）引物设计：从基因BANK检索Smad4基因的全序列（基因号AB010954），设计正链引物序列为5’ATCCTGGACATTACTGGCCGGTTCA3’反义链引物序列为5’TGCCGCCTGGGCAGCAGCTGCGGCT3’。扩增片段为大小为500BP（2）内对照基因使用GAPDH，设计正义链为5’-TGCACCCACGACAGAAGGGGA-3’ 反义链为5’GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3’扩增片段为大小为349BP（3）标本总RNA提取：从-80度冰箱里取黄豆大小酒精肝组织，加液氮用研钵研磨，加1mlTrizol试剂，再加氯仿提取总RNA，无水乙醇沉淀，溶解于DEPC水处理过的蒸馏水中，提取的RNA经过分光光度计测定OD值，要求OD260/OD280>2.(4)逆转录 参照上海生工MMLV逆转录试剂盒说明书，合成cDNA，取总RNA稀释至浓度为50ug/ul取10ul总RNA加入1ul oligo dT放入70摄氏度5分钟后冰置，加入4ul 5*缓冲液 2ul4dNTP Mix 2ul 用双蒸水加至19ul，37摄氏度5分钟后再加入200u MMLV（1ul）42摄氏度孵育60分钟后转入70度水浴，获得cDNA低温冰箱保存（5）PCR反应 模板cDNA2ul各引物1ul Tag酶0.2ul加入4ulPCRMIX（含10mM4dNTP0.8ul，25mmol/LMgCL2 1.2ul，10*buffle2ul）加水至20ul反应体系。按以下程序进行基因扩增，95C5’-(95C1’-61C1’-72C2’)35循环-72C10’ (5)取10ulPCR反应产物与2ul
溴酚兰混合加样于电泳槽以5v/cm进行电泳，行荧光扫描。（5）各个标本CDNA循以上方法进行扩增内对照GAPDH，并电泳，行荧光扫描。（6）经荧光扫描获得两组各个标本的Smad4/GAPDH 值。
7、统计学处理 用SPSS11.5进行分析，组间均数比较采用Independent-Sample T Test，并进行Spearman相关性分析。
结 果
1、肝组织纤维化染色（Masson染色） 发现C组标本的汇管区，纤维间隔，血管壁均被染为墨绿色。A组织和B组只有少量血管壁被染为墨绿色。说明C组酒精肝模型归属典型的酒精性肝纤维化期。A组和B组无纤维化表现。
2、酒精肝肝组织中Smad4蛋白的表达（定性） 免疫组织化学染色发现C组所有切片组织切片中多区域明显染为棕黄色，说明这些区域中Smad4表达强度较高。这些区域主要是汇管区非实质细胞，肝小叶周围，窦壁周围，纤维间隔。A组和B组基本上无棕黄色染色，说明A组和B组标本基本上无Smad4表达。
荧光强度比（Smad4/GAPDH）
编号 A组 C组
1 0.12 2.37
2 0.29 2.02
3 0.21 10.53
4 0.11 1.38
5 0.38 2.88
6 0.002 1.5
7 0.25 2.9
8 0.20 1.34
9 0.18 1.25
10 0.22 3.08
均值（X+S） 0.20+0.104 2.93+2.76
两组均值经t检验有显著差异（P<0.01）。
4、Spearman相关性分析表明，Smad4表达程度与肝纤维化呈正相关（P<0.01）。
讨 论
`酒精肝按病理过程可以分为，酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝纤维化，酒精性肝硬化四个类型。其中酒精肝晚期的酒精性肝纤维化、肝硬化的基本病理改变是出现胶原纤维大量增生。
近年研究发现，TGF-beta下游存在一个复杂的Smad，TGF-beta的信号通过Smad家族实现对基因的调控。GF-beta直接结合TBRII或通过B-多聚糖间接结合TBRII，形成TGF-beta/ TBRII复合物并迅速导致TBRI的磷酸化，磷酸化的TBRI可以活化受体特异性smad（smad2或smad3）使其磷酸化，并与通用型smad（smad4）结合形成异源复合物，转位到核内，调节靶基因的转录。
不同类型的细胞TGF-beta 诱导产生的生物学效应不同，可刺激或抑制细胞生长，产生一个广泛的生物学效应（1） 已有大量实验表明，TGF-beta参与了肝纤维化过程中胶原的增生（2）（3），smad蛋白是TGF-beta受体复合物体下游一类非常重要的信号分子，同时具有转录活化功能，可将TGF-beta超家族的信号直接从细胞膜转入细胞核，与纤维化基因表达相偶连（4），Smad4作为TGF-beta下游的一个重要信号传导分子，它在酒精性肝纤维化中，起着何中作用？为此我们用免疫组织化学的方法考察了，Smad4在酒精肝各阶段组织中的表达情况。结果发现在酒精肝早期和正常肝组织中，纤维化染色是不明显的，Smad4表达也是阴性的，随着酒精肝纤维化程度的提高，在C组肝脏标本中，纤维化染色阳性，Smad4染色也出现了阳性，相关性分析表明，Smad4表达与肝纤维化呈正相关。该实验提示Smad4参与了酒精肝晚期的胶原纤维增生。
参 考 文 献
1.Miyazono K. TGF-beta/SMAD signaling and its involvement in tumor progression[J].Biol pharm Bull,2000,23(10):1125-1130
2.Roulot,Sevcsik AM, Coste T,et al. Role of transforming growth factor beta type 2 receptor
in hepatic fibrosis : studies of humam chronic hepatitis C and experimental fibrosis in rats [J].Heptaology,1999,29(6):1730.
3.Takiya S,Tagaya T ,Takahashi K ,et al . Role of transformation growth factor beta 1 on hepatic regeneration and apoptosis in liver diseases [J]. J Clin Pathol ,1995,48(12):1093.
4.Massague J.TGF-beta signal tranduction. Ann Rev Biochem,1998,67:753-91
