蝙蝠葛酚性碱对K562、BXPC|3增殖的影响

【摘要】  目的观察蝙蝠葛酚性碱（PAMD）在体外的广谱抗肿瘤作用。方法采用MTT比色法测定不同质量浓度的蝙蝠葛酚性碱对体外处理白血病细胞株(K562)、人胰腺癌细胞株(BXPC|3）24 h的存活率，同时测定药物处理不同细胞株的细胞增殖抑制率和IC50及IC90。实验设立阴性空白对照组和氟尿嘧啶阳性对照组。结果不同质量浓度蝙蝠葛酚性碱对K562、BXPC|3细胞株的细胞增殖具有抑制作用，抑制作用均与质量浓度呈梯度关系。结论蝙蝠葛酚性碱对体外培养人肿瘤细胞株的增殖有明显的抑制和杀伤作用，揭示其具有细胞毒效应，蝙蝠葛酚性碱产生抗肿瘤生物学效应的机理有待进一步研究。

【关键词】  蝙蝠葛酚性碱 人肿瘤细胞株 MTT比色法 细胞毒

    蝙蝠葛酚性碱(phenolic alkaloids of menispermum dauricum,PAMD)是从中药蝙蝠葛(Menispermum dauricum,DC)根茎中提取的多种脂溶性生物碱的混合物,实验已证明其主要成分为蝙蝠葛碱(dauricine，Dau)和蝙蝠葛苏林碱(daurisoline，Ds)，Dau和Ds均为双苄基异喹啉类生物碱，脂溶性高，具有抗钙活性。PAMD具有较好的抗心律失常以及保护脑缺血—再灌注损伤作用, 且副作用小, 已作为心脑血管疾病的新药供临床使用[1-3]。但关于PAMD抗肿瘤的作用未见报道，因此我们采用体外培养的方法研究PAMD的抗肿瘤活性，并对药物的敏感瘤株进行筛选。

    1  材料与方法

    1.1  细胞和细胞培养

    人白血病细胞株（K562）、人胰腺癌细胞株（BXPC|3）由中科院上海生物细胞所引进。体外细胞培养于含10 %小牛血清以及100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的1640培养液中，37 ℃,5 %CO2培养箱内培养，细胞长至对数生长期用于实验。

    1.2  实验药品

    蝙蝠葛酚性碱由药学院王栋教授提供。实验时用生理盐水配制成0.625，1.25，2.5，5，10，20， 40 μg/mL质量浓度的混悬液，用0.22 μm微孔过滤除菌，置-20 ℃冰箱保存备用。氟尿嘧啶注射液（2.5 g/mL），天津金耀氨基酸有限公司，批号：H12020959。

    1.3  试剂和仪器

    RPMI1640购自Gibco公司，以10.4 g溶于1 000 ｍＬ三蒸水中，用NaHCO3调pH值到7.0，过滤除菌，4 ℃冰箱保存。胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司,经56 ℃、30 min灭活处理后，置-20 ℃冰箱保存备用。四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲亚砜（DMSO）均购自sigma公司。DG5031型酶联免疫仪为华东管厂产品。

    1.4  MTT法筛选蝙蝠葛酚性碱的抗癌瘤谱[4]

    取对数生长期的K562、BXPC|3细胞株,配制成1×107/mL单细胞悬液，接种于96孔培养板,每孔0.1 mL,实验组分别加入蝙蝠葛酚性碱至终质量浓度为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625 mg/L，每个药物质量浓度设6个复孔，空白对照组不加药，置于37 ℃饱和湿度5 ％CO2条件下常规培养24 h，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，再置培养箱内继续培养4 h。吸取上清液，每孔加入100 μL DMSO振荡5 min，用酶联仪在570 nm波长下测定各孔光吸收值(OD值)，记录结果。细胞抑制率公式为：

    细胞抑制率=(空白对照组OD均值-药物组OD均值)/空白对照组OD均值×100 %。

    按下列公式计算肿瘤细胞的存活率，判断蝙蝠葛酚性碱对肿瘤细胞的敏感性（肿瘤细胞的存活率＜30 %为高度敏感，30 %～50 %为中度敏感，＞50 %为不敏感）,同时计算IC50和IC90，实验在相同条件下重复3次。

    细胞存活率=实验组光吸收值/空白对照组光吸收值×100 %

    1.5  统计学处理

    实验数据以(±s)表示，采用t检验比较各组的OD值，采用线性回归计算IC50和IC90。

    2  实验结果

    2.1  蝙蝠葛酚性碱对肿瘤细胞的增殖抑制作用

    不同质量浓度的蝙蝠葛酚性碱处理BXPC|3、K562细胞株24 h后，对BXPC|3、K562细胞株的抑制率随着质量浓度的增加而增大；实验组各剂量组与阳性对照组比较，质量浓度为40，20，10，5，2.5 μg/mL时，对BXPC|3细胞株的抑制率显著高于5|FU(P＜0.01)，质量浓度为40，20，10 μg/mL时，对K562细胞株的抑制率显著高于5|FU(P＜0.01)。表明蝙蝠葛酚性碱对肿瘤细胞的增殖具有良好的抑制作用。见表 1。 表1PAMD对人肿瘤细胞株的影响注：与空白对照组比较*P＜0.01，**P＜0.001；与阳性对照组比较△P＜0.01

    2.2  蝙蝠葛酚性碱对敏感肿瘤细胞的筛选

    不同质量浓度的蝙蝠葛酚性碱作用于BXPC|3、K562细胞株24 h时均有明显的细胞毒效应，其中以BXPC|3最为敏感，当蝙蝠葛酚性碱质量浓度为40 μg/mL时，细胞的存活率仅为8.96 %，而同一剂量处理K562细胞株24 h的细胞存活率为17.91 %。各细胞存活率与蝙蝠葛酚性碱的质量浓度呈负相关。不同质量浓度的蝙蝠葛酚性碱对各细胞株存活率的影响见图1。实验结果表明BXPC|3、K562对蝙蝠葛酚性碱的作用都有较强的敏感性。

    2.3  蝙蝠葛酚性碱对肿瘤细胞毒的IC50和IC90

    蝙蝠葛酚性碱对上述两种人癌细胞株均有明显的体外细胞毒作用，并且其细胞效应与蝙蝠葛酚性碱的质量浓度呈正相关,两种人肿瘤细胞株的IC50和IC90值见表2。表2PAMD对BXPC|3、K562的细胞毒效应

    3  讨论

    肿瘤的发生、严重威胁人们的生命，已经是人类健康的大敌。肿瘤学也成为世界医学研究领域的重点。在肿瘤的方面，除了传统的手术、放疗与化疗，又出现了基因干扰和靶向治疗，使肿瘤的防治工作有了突破性进展。同时工作者应用中药进行综合调节治疗也成为近年研究的热点领域，使得中药复方或单味中药提取的有效成分在抑制肿瘤细胞增殖、转移、侵袭和诱导肿瘤细胞分化，促进凋亡以及逆转肿瘤细胞多药耐药、减毒增效等方面进入了一个新的时代。

    近年来研究发现，从中药中提取的一些生物碱类物质在肿瘤防治方面具有重要作用, 如从紫唐松草和唐松草等的根中分离得到的唐松草碱和厚果唐松次碱对W256有显著的抑制作用，国外已进入临床研究[5]。从贴梗木瓜和番木瓜分离的番木瓜碱, 具有显著的抗淋巴细胞性白血病L1210 的活性作用，对L388、鼻咽癌肿瘤细胞也有中等程度的抑制作用。从苦参以及山豆根的根中提取的苦参碱，对S180、U14及艾氏腹水癌均有抑制作用，氧化苦参碱对S180有抑制作用, 并具有明显升高白细胞的作用，临床上用于结肠癌、直肠癌及肝癌的治疗[6]。从山豆根中提取的异喹啉类生物碱(蝙蝠葛碱)和从胡椒果实中分离的主要生物碱(胡椒碱)对CNE|1、CNE|2Z鼻咽癌细胞株的生长增殖均有抑制作用，并呈时间依赖性抑制[7]。

    已有研究表明蝙蝠葛酚性碱对心肌Na+、K+、Ca2+的转动过程均有非特异性抑制作用，抑制了Ca2＋|ATP酶的活性, 使肌浆网钙的摄取下降, 同时Dau和Ds还具有抑制钠离子内流、钙离子内流和钾离子外流的作用，并具有逆转肿瘤多药耐药性的作用[8-10]。本实验对蝙蝠葛酚性碱抗肿瘤效应进行筛选，研究结果发现，蝙蝠葛酚性碱对K562和BXPC|3细胞株增殖均有抑制作用，其中对BXPC|3作用最为敏感，24 h的抑制率高达91.04 %，其IC50和IC90分别为2.30 μg/mL和30.78 μg/mL。

    目前，国内未见对应用蝙蝠葛酚性碱进行抗肿瘤的实验研究，我们对蝙蝠葛酚性碱抗肿瘤的初步筛选时发现，它具有明显抑制肿瘤细胞增殖的作用，显示出良好的抗肿瘤效应，实验结果揭示其对肿瘤细胞具有细胞毒作用，但蝙蝠葛酚性碱产生抗肿瘤生物学效应的机理还有待进一步研究。

【】
  [1]苏云明，李永强，周媛，等.蝙蝠葛酚性碱对实验性心肌缺血保护作用的研究[J]．药师，2002，5（6）：326.

[2]杨瑞琪，苏云明. 蝙蝠葛酚性碱对实验性脑缺血保护作用的研究（一）[J]．中医药信息，2002，19（5）：61.

[3]Wang F, Zhao G, Ly Q, et al. Protective effect of phenolic alkaloids from Menispermum dauricum on myocardial cerebral ischemia/reperfusion injury in rabbits[J].Chin Crit Care Med, 2005,17(3):154-156.

[4]Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survial:Application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods,1983,(65):55-63.

[5]李映丽，吕居娴，焦文旭，等.抗肿瘤的天然化合物[J].西北药学杂志,1994,9 (6):257-260.

[6]陈瑞婷.一些植物成分对实验肿瘤的作用[J].中国医学杂志, 1990,27(7):307-308.

[7]丁航，唐旭东，周克元.蝙蝠葛碱和胡椒碱对两株鼻咽癌细胞增殖的影响[J].广东医学院学报，2003，21（1）：16-17.

[8]龚培力，涂红云.蝙蝠葛酚性碱抗心律失常作用的研究[J].中药新药与临床药理，1995,6(3)：13-17.

[9]管思明. 蝙蝠葛碱对心肌电生理和肌浆网Ca2+|ATP酶的效应及其与汉防己甲素比较研究[J].中华心律失常学杂志，1999，3（4）：286-289.

[10]田晖，潘启超.双苄基异喹啉生物碱蝙蝠葛碱与蝙蝠葛苏林碱逆转多药耐药性的比较研究[J].癌症，1996,15（6）：410-414.