大鼠孤束核内H3 受体对哮喘发作时脑组织中Fos蛋白表达的影响

                作者：胡春梅，董榕，刘保森，张晓红，季吉

【关键词】  哮喘
    
　　Abstract:Objective To investigate the expression and distribution of the estrogen receptors（ER）in the lung of male rats.Methods The expressions of ER.αmRNA and ER.βmRNA in lung tissues was detected by reverse transcription-poly-merase chain reaction（RT-PCR），and ER.βprotein in lung was detected by immunohistochemistry.Results Aside from weak expression of ER.αmRNA，lung tissue showed moderate expression of ER.βmRNA.The positive ER.βimmunoreac-tivity was presented in columnar epithelium，intermediate cells，basal cells，smooth muscle cells of lung tissue and in pulmo-nary vascular smooth muscle cells，endothelial cells.Conclusion ER.βis distributed in lung tissue of male rats.
  
　　Key words:estrogen receptor;lung tissue;immunohistochemistry;rats

     ［摘要］目的: 探讨大鼠孤束核（NTS）内组胺H3 受体对哮喘发作时大脑Fos蛋白表达的影响及其意义。 方法: 取健康雄性SD大鼠制备哮喘模型并诱发哮喘发作，采用中枢立体定位及微量注射技术，分3组分别在NTS内微量注射无菌生理盐水、H3 受体激动剂R.α.methylhistamine（RMHA）以及H3 受体拮抗剂thioperamide（Thio）加RMHA，用SABC免疫组织化学方法测定大鼠哮喘急性发作后1hFos蛋白在丘脑至延髓平面各核团的分布情况。 结果: 与哮喘组相比，哮喘大鼠NTS内微量注射1μgRMHA，丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、NTS等核团Fos蛋白表达减少，阳性细胞数降低，差异有显著性（P<0.01）;而用Thio5μg预处理则可拮抗RMHA的上述效应。 结论: NTS内H3 受体可能通过丘脑室旁核、下丘脑室旁核和室周核等脑区相关神经元参与对哮喘的神经调控，从而可能抑制哮喘发作。
    
　　［关键词］ 大鼠;孤束核;H3 受体;哮喘;Fos蛋白;表达

　　支气管哮喘是一种常见的气道慢性变态反应性炎症，发病机制非常复杂，其中涉及多种炎性细胞和炎性介质，目前已证实c-fos参与了气道炎症反应。c-fos是一种即刻早期基因，在生理状态下即有低水平表达，调控着多种细胞的生长和分化，参与重要脑功能活动的信号转导和调控过程，已被公认为脑功能活动形态学定位标记物之一［1］ 。本研究拟在大鼠孤束核（nucleus tractus solitarius，NTS）内微量注射H3 受体激动剂（R.α.methylhistamine，RMHA），用Fos蛋白抗体免疫组织化学方法检测丘脑至延髓平面各核团Fos蛋白的表达情况，初步探讨NTS内H3 受体可能通过哪些脑区神经元来调控大鼠哮喘发作时的呼吸运动，从而为揭示哮喘发病机制和开发有效的抗哮喘药物提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 哮喘模型制备
    
　　雄性成年SD大鼠28只，体重250～300g，由东南大学医学院实验动物中心提供，在安静、温暖（18～25℃）、避强光、明暗周期为10.14h的实验室预饲养1周后，随机取24只大鼠分成哮喘模型组（n=18）和生理盐水（NS）对照组（NS组，n=6）。实验第1天，每只模型组大鼠腹腔注射用卵蛋白（OVA）粉末100mg、氢氧化铝干粉100mg、灭活的百日咳杆菌5×109 个配成的混悬液1ml1次，自第15天开始用超声雾化器给大鼠雾化吸入1%OVA NS溶液（2～3ml・min-1 ，颗粒直径≤5μm），每天1次，每次均以哮喘症状出现（烦躁不安、呼吸急促、用力呼吸、呼吸困难、喘息、腹肌明显收缩、咳嗽等）作为指标，连续3d。NS组大鼠在致敏和吸入激发阶段均以NS代替OVA混悬液，且吸入时间为同批哮喘模型组鼠最长诱喘时间。　　

    1.2 核团定位和给药方法
    
　　模型大鼠乌拉坦1g・kg-1 腹腔注射麻醉后，将鼠头固定于立体定位仪上，参照Paxinons-Watson大鼠脑立体定位图谱，以前囟为零点，定位左侧NTS，即位于AP-12.80mm，L1.2mm，H8.0mm。在给药部位借助立体定位仪预先埋一外径为0.78mm的不锈钢管作为注射引导管，用502胶固定。用外径0.38mm的不锈钢管作为注射管，注射管长于引导管0.5mm，用一细聚氯乙烯管将注射管和微量注射器相连，将注射管插入引导管中准备给药。给药体积均为1μl，用微量注射机恒速（1μl・min-1 ）注射，注射后留管2min。其中RMHA（Sigma公司）临用前用无菌NS配制成1μg・μl-1 和2μg・μl-1 ;H3 受体拮抗剂thioperamide（Thio，Sigma公司）用无菌NS新鲜配制成10μg・μl-1 ，pH7.2～7.4，低温保存，注射前置于37℃水浴箱中加温。

    实验结束后用相同给药法在原点注射等体积美蓝后，将大鼠头浸泡在10%的甲醛液内，7d后冰冻切大鼠脑片（40μm），查找注射点，对照大鼠脑图谱确定注射部位，凡注射部位不在NTS的实验动物均剔除。

　　1.3 实验分组
    
　　将已成功制备的哮喘模型大鼠按NTS处注射不同药物再随机分为哮喘组（OVA加NS组）、OVA加RMHA组及OVA加Thio加RMHA组3组，每组6只，即各组在静脉注射OVA溶液（40mg・kg
-1 ，共0.1ml）诱发哮喘急性发作后，分别往NTS内微量注射1μl无菌NS、1μgRMHA、5μgThio加1μgRMHA（先注射Thio，后注射RMHA）。
   
　　NS组经静脉注射0.1ml无菌NS后，NTS内微量注射1μl无菌NS。

    另外为了排除手术对Fos蛋白的影响，增设了假手术组（n=4），即NTS内埋管但不给药。

　　1.4 组织标本制作
    
　　各组大鼠NTS内微量注射相应的药物后开胸，暴露心脏，于心尖处剪开心脏，经左心室至升主动脉插管，剪开右心耳。先用100～200ml NS快速冲洗，再用4℃4%的多聚甲醛溶液400ml持续灌注内固定，先快后慢，直至大鼠出现四肢及头尾伸直变硬为止，一般约2h。灌注完毕后去顶骨，小心取出脑，置4℃4%的多聚甲醛溶液中固定4h，然后放入30%的蔗糖溶液中4℃过夜。

    
　　1.5 免疫组织化学方法（SABC法）
    
　　取出组织标本，在相同平面切取丘脑、下丘脑和延髓（含注射区），冰冻切片机连续冠状切片，厚度为40μm，每5张取1张作免疫组织化学染色，收集在切片盒中，注意给药点在脑片留下的痕迹，并将注射点跟脑图谱相应的位置比较，剔除定位不准确的标本。脑片按试剂盒要求及步骤进行染色，即将切片放入0.3%甲醇H2 O2 溶液中浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，然后用0.01mol・L-1 的PBS充分洗3次，每次10min。滴加一抗（1∶200的兔抗Fos），室温下孵育30min，4℃冰箱中再孵育48h。用0.01mol・L-1 的PBS充分洗3次，每次10min。滴加生物素化的羊抗兔抗体（1∶100），37℃2h，0.01mol・L-1 的PBS充分洗3次，每次10min。加入链霉亲合素.生物素.过氧化物酶复合物（SABC），在室温下孵育60min，取出用0.01mol・L-1 的PBS充分洗3次，每次10min。再放入0.5mol・L-1Tris-HCl中预浸泡2min，最后用葡萄糖氧化酶.DAB.硫 酸镍铵液显色，常规裱片，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组织化学染色替代试验:取试验组大鼠部分组织切片，用0.01mol・L-1 的PBS代替兔抗Fos一抗，其他步骤同上。显微镜观察，照相，图像分析。 1.6 Fos阳性细胞计数脑片经组织化学染色后，以镜下细胞核被染成棕黄色或棕褐色为Fos阳性细胞。取每只大鼠每个核团对应的典型平面2～3个，在10（目镜倍率）×10（物镜倍率）光镜下观察计数，并根据网格大小单位面积的Fos阳性细胞个数（个・mm-2 ）。取该例动物各平面的平均数，即为该动物该核团的Fos阳性细胞计数，每组6个动物间取平均值，即为该组动物该核团的Fos阳性细胞计数。实验结果以ˉx±s表示，采用t检验，P<0.05表示差异有显著性意义。
 
　　2 结  果
    
　　2.1 显微镜观察结果
    
　　各试验组大鼠部分组织切片的免疫组织化学染色替代实验结果呈阴性。假手术组和NS组中大鼠丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、NTS等均可见散在的Fos分布，多为浅染，数量很少，且无密集分布区，两组间无明显差别，提示手术不会影响Fos蛋白的表达。OVA加NS组的Fos阳性细胞表现为核深染，圆形，边缘光滑，胞质不着色，主要密集分布于丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、外侧区、NTS、最后区和延髓腹外侧区内。而在OVA加RMHA组，丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、外侧区、NTS、最后区和延髓腹外侧区内均可见Fos阳性细胞，但表现为核浅染，数量少且无密集区，与OVA加NS组比较，Fos阳性细胞明显减少，尤其是NTS区、下丘脑室旁核、外侧区、室周核FOS阳性细胞显著减少，基本接近NS组。在OVA加Thio加RMHA组，上述核团均可见大量深染、密集的Fos阳性细胞，与OVA加RMHA组相比，Fos阳性细胞数量明显增加，而与OVA加NS组接近。

　　2.2 Fos阳性细胞计数
    
　　与NS组比较，OVA加NS组丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、NTS Fos蛋白表达细胞数明显增高，差异有显著性（P<0.01）。OVA加RMHA组上述核团的Fos蛋白阳性表达细胞数显著降低，与NS组基本接近，与OVA加NS组相比差异有显著性（P<0.01）。OVA加Thio加RMHA组在上述核团的Fos蛋白表达阳性细胞数明显增高，和OVA加NS组的结果相似，与OVA加RMHA组相比差异有显著性（P<0.01）。见表1。 表1  NTS内微量注射RMHA对哮喘大鼠不同核团Fos蛋白表达的影响（略）

　　3 讨  论
   
　　哮喘是一种由IgE介导的全身性免疫反应。尽管在免疫系统内部存在着精细的自我调节机制，但它并不是一个孤立的系统。目前研究认为，中枢神经系统和免疫系统之间存在着双向的联系［2］ 。以往有关于细胞因子、炎症介质、免疫细胞等的研究甚多，但多是孤立的免疫学研究，很少将哮喘与机体整体调节联系起来。有研究［3］ 在小鼠腹腔注射脂多糖来模拟机体免疫激发状态，结果发现大脑皮层、边缘前脑、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、延髓NTS等区的c-fos原癌基因表达增强，进一步肯定了中枢对免疫反应的调节作用及神经免疫调节通路的存在。本研究发现，大鼠和豚鼠哮喘发作时，丘脑室旁核、下丘脑室旁核、室周核、延髓NTS等核团Fos蛋白表达明显增多，提示哮喘发作时，上述脑区参与哮喘的神经调控，但可能通过的调控途径至今未见报道。因此，作者选择作为脑功能“调节者”的组胺H3 受体为锲入点，观察哮喘发作时，NTS微量注射H3 受体激动剂对脑组织内Fos蛋白表达的影响，初步探索可能的神经调控途径。结果发现，与OVA加NS组相比，当NTS内给予H3 受体激动剂RMHA后，NTS区和下丘脑室周核、室旁核、外侧区Fos蛋白表达显著减少，差异有显著性。当用拮抗剂Thio预处理后再给RMHA，上述核团Fos蛋白表达明显增多，与OVA加NS组相似。可见，上述核团Fos蛋白表达数量的多少与NTS H3 受体是否激动有关。作者推测，NTS注射RMHA后，药物可能作用于延髓呼吸中枢，激活H3 受体，减少组胺以及其他递质的释放，减少NANC神经末梢释放炎症介质SP等，改善哮喘症状。

    同时，NTS作为内脏感觉中继站，可能将改善了的哮喘刺激信息上传给下丘脑、丘脑高位中枢，构成一个“NTS.丘脑”通路，从而导致上述核团Fos蛋白表达减少。本实验室曾观察到哮喘发作时及侧脑室注射H3 受体拮抗剂Thio后脑内组胺含量增加［4］ 。一旦组胺含量增加，在下丘脑水平可促进垂体释放多种激素，如促肾上腺皮质激素、血管紧张素、催产素等。组胺的促激素释放作用可能是刺激下丘脑室旁核和视上核血管紧张素细胞，产生皮质激素释放因子而间接引起。下丘脑内组胺能纤维也可到达脊髓，调节交感神经元的活性［5］ 。此外，文献报道切断迷走神经可抑制过敏原引起的延髓内脏带及其上行投射核团内的Fos蛋白表达［6］ ，表明哮喘信息通过迷走神经传入延髓。因而，作者推测NTS内H
3 受体可能通过“下丘脑.垂体.肾上腺”、“下丘脑.脊髓.交感神经”和“下丘脑、丘脑等高位中枢.MVZ.迷走神经”发挥对哮喘的神经调控作用，使神经源性介质P物质释放减少，从而使呼吸功能明显改善。
   
　　由此可见，NTS内H3 受体可能通过“下丘脑.垂体.肾上腺”、“下丘脑.脊髓.交感神经”和“下丘脑等高位中枢.MVZ.迷走神经”等途径发挥其神经调控作用，抑制NANC神经末梢释放炎症介质SP等来抑制哮喘发作。由于中枢神经系统H3 受体对哮喘的调控机制十分复杂，本实验对这方面的研究仅仅处于初步探索阶段，仍有待进一步探讨。
    
　　［文献］
     
    ［1］SAGAR S M，SHARP F R.Early response genes as markers of neuronal activity and growth factor action［J］.Adv Neurol，1993，59:273.284.

    ［2］KLECHA A J，GENARO AM，LYSIONEK A E，et al.Experimental evidence pointing to the bidirectional interaction between the im- 东南大学学报 （医学版）J Southeast Univ（Med Sci Edi）   2005，Nov;24（6）:374.376  mune system and the thyroid axis［J］.Int J Immunopharmacol，2000，22（7）:491.500.
   
　　［3］杨志军，葛煦，饶志仁，等.Fos蛋白在LPS免疫激发大鼠脑内的分布［J］.解剖学报，2000，31（4）:292.295.

    ［4］董榕，张敏.哮喘豚鼠脑内组胺含量变化及中枢组胺H3 受体的调节作用［J］.医学，2003，31（3）:154.156.

    ［5］BROWN R E，STEVENES D R，HAAS H L.The physiology of brain histamine［J］.Prog Neurobiol，2001，63（6）:637.672.

    ［6］杨志军，饶志仁，鞠躬.膈下迷走神经切断术抑制腹腔给予LPS诱导的延髓内脏带内Fos表达［J］.解剖学报，2000，31（2）:97.101.