乙型肝炎病毒X基因区序列的系统发育树分析

来源:岁月联盟 作者: 时间:2010-07-12

              作者:张豪,孙桂菊,钱耕荪,屠红


[摘要]目的: 研究利用乙型肝炎病毒X基因区序列构建系统发育树进行基因型分析的可靠性。 方法: 从美国NCBI基因库中下载HBV全基因序列共249条,其中166条为已知基因型的序列,83条为未知型序列。利用ClustalX1.8软件和TreeView软件对已知基因型的X区序列构建进化树图,分析由该方法获得的基因型是否与原来的吻合,并对未知型序列进行基因型分析,再用S区的进化树分析加以验证。 结果: 已明确基因型的166条序列利用X基因区序列分析得到的基因型与原先的基因型完全吻合。用X区和S区序列分析方法对83条未知型序列分析的结果是一致的,分别获得A型16条、B型17条、C型27条、D型21条及F型2条,未发现E、G和H型。 结论: 利用乙型肝炎病毒X基因区序列进行基因型分析是完全可靠的,有助于HBV的致病机制研究。
    
  [关键词] 乙型肝炎病毒;基因型;系统发育树;X基因
    
  乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝DNA病毒科,具有双链DNA分子结构,全长大约3.2kb。由于HBV以mRNA为中间体进行逆转录复制,复制过程缺乏校对酶的作用容易发生碱基配对错误,导致HBV基因突变十分频繁。虽然HBV的血清型分型已建立多年,但不能深刻反映HBV病毒的变异,其临床上意义也不大。HBV基因型分型方法以HBV全基因序列核苷酸异源性≥8%为不同基因型的分型标准[1] ,至今已发现A~H8种基因型。HBV的X基因在致肝病过程中起着至关重要的作用,它与肝癌的发生有着密切的联系。目前还没有利用X基因序列对HBV进行基因型分型的相关报道,作者利用NCBI基因库中的资源,对用X基因序列进行HBV基因分型作一研究。

  1 材料与方法
    
  1.1 HBV基因序列的来源
    
  利用互联从美国NCBI基因库(http:..www.ncbi.nlm.nih.gov)中下载HBV全基因序列249条。这些序列均来源于人类HBV感染者,动物源性的HBV及不常见的双基因型杂合HBV不在本研究之列。
    
  1.2 HBV X基因序列的多重比对与系统发育树的构建

  在完整HBV基因序列中选取X基因序列,以Fas-ta格式导入ClustalX1.8软件中,用多重比对模式进行比较,绘制N.J树,生成ph文件,然后导入TreeView软件来构建系统发育树图,待基因型分析用。

  1.3 HBV基因型分析
    
  分析由已知基因型的166条序列的X区构建的系统发育树,以确定基因分型是否与原来基因库中的基因型一致。以已知基因型别的HBV基因序列为标准,将未知型的基因序列与标准序列一起构建系统发育树,以已知基因型序列在进化树中所处的位置作为分型的依据,来判别其它序列的基因型,从而明确它们归于何种基因型,同时利用国内外广泛使用的S区序列分析加以验证。

  2 结果
    
  2.1 HBV基因序列
    
  从NCBI基因库中下载的HBV全基因序列总共249条,经过分析发现其中已知基因型的有166条,分别为A型39条、B型35条、C型34条、D型21条、E型3条、F型30条、G型1条及H型3条。这些序列在NCBI基因库的登记号及基因型别见表1。

  表1  基因库中已知基因型序列的登记号(略)
   
  Tab1 Registered number of the definitive HBV genotype in NCBI
  
  2.2 HBV的X基因序列系统发育树分析
    
  在下载的HBV全基因序列中选取已明确基因型的序列,利用ClustalX1.8和TreeView两种软件进行X基因序列的系统发育树分析,如图1所示。结果显示,利用X基因序列的系统发育树分析产生的基因型与其在NCBI基因库中登记的基因型完全吻合。另外结果还显示,在NCBI基因库中用各种方法已确定的属于基因型F的基因序列之间存在着较大的异源性,形成两个分支,可能是同属于基因型F的两个亚型。

  2.3 基因库中未分型序列的进化树分析
    
  以已知基因型序列为标准,将83条未知基因型序列与标准序列一起进行X基因的系统发育树分析。分析得出A、B、C、D和F型的序列条数及其基因库的登记号,见表2,未发现E、G和H型的序列。在这83条序列中选出前S.S区完整的序列构建系统发育树得到的基因型与利用X区序列分析的结果是一致的。

  3 讨论
    
  1988年Okamoto通过对18株不同血清型的HBVDNA全序列比较后发现,血清型不能真正反映HBV基因组的差异,并将全基因序列差异≥8%定为HBV不同的基因型。到目前为止,已经发现了A~H8种不同型别的基因型。HBV基因型的分布具有明显的地域性。A型主要分布于西欧、北欧、北美洲及非洲地区;B型和C型主要分布于亚洲和澳大利亚;D型分布最为广泛,主要分布于中东、北非和南欧及地中海地区;E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带;F型主要分布于美国;G型在法国和美国被发现;H型已在尼加拉、墨西哥及美国加里弗尼亚地区被发现。在我国HBV基因型主要是B型和C型。HBV基因型的不同,其临床意义也不同。目前认为C型病毒引起的临床后果比B型要严重得多。感染HBV C型的患者,其丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常率和e抗原的阳性率明显高于感染HBV B型者,同时也具有慢性肝炎、肝硬化为肝细胞癌的趋势[2] 。
 
  图1 已知基因型X基因序列的系统发育树(略)
   
  Fig1 Phylogenetic tree construction of the clear sequences on X region
    
  表2  基因库中未知基因型序列的系统发育树分析结果(略)
   
  Tab2 Registered number of the unknown HBV genotype in NCBI GenBank

  目前,国内外对HBV的基因分型方法可分为序列分析、聚合酶链反应.限制性酶切长度多态性分析(PCR.RFLP)[3] 、多重PCR基因分型[4] 、分子杂交以及单克隆抗体ELISA5类。虽然序列分析较其他方法复杂,但其他方法有着各自的缺点,例如在PCR.RFLP方法和分子杂交的方法中,相关位点的核苷酸发生突变将直接影响基因分型结果,而在序列分析中这不会对结果产生影响。序列分析是最可靠的方法,可以分为全基因序列分析和片断基因序列分析,HBV全基因序列分析是基因分型的金标准。由于全基因序列分析比较麻烦,国内外通常用S区序列来替代全基因序列分析[5] 。本研究结果表明,利用X基因区序列分析也能将目前的各种基因型完全分开,另外还发现NCBI基因库中已知的F型基因存在两个亚型,通过发现这两个亚型之间的X基因区序列最大异源性为4.5%。S区和X区的序列分析从方法的本质上来讲是相同的。由于S区的保守序列多异质性少,其构建的系统发育树的成簇分支结构比X区要紧密。然而两者的基因分型能力并无差别,因为无论是在S区还是X区,不同基因型之间序列的异源性都很大。
   
  在研究HBV的致病机制时,由于HBV的X基因编码产生的HBx蛋白具有广泛的反式激活作用;X基因区的基本核心启动子(BCP)A1762T和G1764A双突变能影响前核心HBeAg、核心蛋白HBcAg和聚合酶的翻译,它与HBV的基因型及肝癌的发生有着密切的关系[6,7] ,因此常常需对HBV的X基因序列进行测序分析。本研究方法是对X基因序列的充分利用,为实验研究节省了时间和经费,同时为HBV的基因分型提供了一种新的可靠的途径,可以推广使用。

  []
     
  [1]OKAMOTO H,TSUDA F,SAKUGAWA H,et al.Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence:comparison of surface antigen subtypes[J].J Gen Virol,1988,69:2575.2583.
   
  [2]DING X,MIZOKAMI M,YAO G,et al.Hepatitis B virus geno-type distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shang-hai,China[J].Intervirology,2001,44(1):43.47.
   
  [3]MIZOKAMI M,NAKANO T,ORITO E,et al.Hepatitis B virus genotype assignment using restriction fragment length polymorphism patterns[J].FEBS Lett,1999,450(1.2):66.71.
   
  [4]NAITO H,HAYASHI S,ABE K.Rapid and specific genotyping for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type.specific primers[J].J Clin Microbiol,2001,39:362.364.
   
  [5]NORDER H,COUROUCE A M,MAGNIUS L O.Complete ge-nomes,phylogenetic relatedness,and structural proteins of six strains of the hepatitis B virus,four of which represent two new genotypes[J].Virology,1994,198(2):489.503.
   
  [6]ORITO E,MIZOKAMI M,SAKUGAWA H,et al.A case.control study for clinical and molecular biological differences between hep-atitis B viruses of genotypes B and C.Japan HBV Genotype Re-search Group[J].Hepatology,2001,33(1):218.223.
   
  [7]LIN C L,LIAO L Y,LIU C J,et al.Hepatitis B genotypes and precore.basal core promoter mutants in HBeAg.negative chronic hepatitis B[J].J Gastroenterol,2002,37(4):283.287.