糖尿病大鼠肾脏细胞外基质金属蛋白酶诱导因子和基质金属蛋白酶2的表达

                   作者：倪海锋 ，邓红 ，樊翔，李懿萍，李海浪，陈平圣   

［摘要］目的：研究糖尿病大鼠肾脏组织中细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)和基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达，探讨糖尿病肾病的发病机制。方法：将SD大鼠随机分成正常对照组(NC组)和糖尿病模型组(DM组),DM组腹腔注射链脲佐菌素(55mg・kg-1) 诱导糖尿病大鼠模型，于第4、第8周分批处死大鼠，用免疫组化检测EMMPRIN、MMP2表达，图像分析仪分析。结果：正常大鼠EMMPRIN、MMP2主要表达在肾小球系膜细胞、内皮细胞、足细胞、球囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞，造模后4、8周时DM组大鼠EMMPRIN、MMP2表达较正常对照组明显下降。结论：糖尿病时肾小球EMMPRIN和MMP2表达水平的降低，可能是引起细胞外基质积聚的原因之一。

　　［关键词］ 糖尿病；细胞外基质金属蛋白酶诱导因子；基质金属蛋白酶2；表达；大鼠

　　Abstract：Objective  To investigate the expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN) and matrix metalloproteinase2 (MMP2) in diabetic rat’s  kidneys. Methods  Rat diabetic model was induced by streptozotocin (55mg・kg-1) , and kidneys were examined pathologically and the expression of EMMPRIN and MMP2 was studied by immunohistochemistry.The intensity of EMMPRIN and MMP2 was analyzed by imaging quantitative analysis technique. Results  EMMPRIN and MMP2 were mainly expressed in the mesangial cells, endothelial cells, podocytes, parietal epithelial cells of Bowman’s capsule, and tubular cells. The expression of EMMPRIN and MMP2 was significantly weakened in the glomeruli of diabetic rats than that of the control animals(P<0.05). Conclusion  Expression of EMMPRIN and MMP2 in glomeruli is markedly decreased in diabetic rats, which is involved in the development of diabetic nephropathy .

　　Key words：diabetic mellitus； extracellular matrix metalloproteinase inducer; matrix metalloproteinase2;expression;rats

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)的严重慢性微血管并发症，基底膜增厚、系膜细胞增生、系膜区细胞外基质(ECM)增多是其特征性的病理改变。众多细胞因子、生长因子表达异常在DN发生中起重要作用。既往对ECM 产生增多的原因研究较多，而关于ECM降解方面的报道相对较少。基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2,MMP2)是肾脏中ECM的主要降解酶之一［1］，而肾脏中MMP的调节机制尚不清楚。细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)参与细胞细胞或细胞间质的粘附，能显著地诱导临近间质细胞基质金属蛋白酶(MMPs)的产生，影响ECM的降解［2］。

　　近年来，国内外对EMMPRIN的研究主要集中在肿瘤浸润和转移方面，但它在DN发病中的作用却少有报道。本研究利用免疫组化法检测DM大鼠肾组织中EMMPRIN及MMP2的表达，旨在探讨EMMPRIN及MMP2和DM肾脏病变的关系，为DN的早期诊断及防治提供实验依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　SD健康雄性大鼠（体重200～250g）购自东南大学医学院动物实验中心，链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)购自美国Sigma 公司，血糖测定采用美国强生ONE  TOUCHEⅡ快速血糖检测仪，兔抗大鼠多克隆抗体MMP2及EMMPRIN购自武汉博士德公司，SP6001免疫组化检测试剂盒购自北京中山生物工程有限公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物造模及处理 

　　SD大鼠36只，随机分为正常对照组(NC组, 18只)和DM模型组(DM组, 18只)。DM模型的制备：采用STZ以新鲜配制的枸橼酸缓冲液（0.1 mol・L-1、pH4.6）稀释成1% 溶液，按55mg・kg-1单侧腹腔一次性注射，以注射72 h后血糖持续高于16.7 mmol・L-1为DM模型建立成功。两组大鼠自由进食饮水，实验中不予任何降血糖药物。

　　1.2.2  实验标本的收集 

　　各组分别于第0、４、８周末检测大鼠血糖、体重，用代谢笼留取24h尿标本，测尿量。同时于第0、４、８周末各组分别处死6只大鼠，取左肾称重 ，左肾与体重的比值作为肾脏肥大程度的指标。大鼠肾脏经10%福尔马林多聚甲醛固定,按梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片，HE染色。

　　1.2.3  免疫组化染色 

　　二步法免疫组化，肾组织石蜡切片常规脱蜡水化，3%的去离子H2O2孵育10min，一抗为兔抗鼠EMMPRIN(1∶50)、MMP2（1∶50），4℃孵育过夜，二抗为辣根酶标记的羊抗兔IgG，DAB显色, 苏木素复染, 脱水透明封片。以PBS代替一抗作为空白对照。光镜观察肾组织病变与EMMPRIN、MMP2的分布， 免疫组化染色以细胞浆或细胞膜有棕黄色颗粒或线状沉积为阳性, 否则每份标本随机选取10个肾小球，测其平均光密度和肾小球阳性细胞表达率，求其均数分别表示每个检测指标的表达强度和分布范围。

　　1.3  统计学处理

　　各项指标以±s表示, 组间均数差异比较用t检验，所有统计过程均用SPSS 10.0 统计软件完成，P<0.05 为有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  一般情况

　　DM组大鼠腹腔注射STZ72h后血糖升高，均大于16.7 mmol・L-1，且一直保持高水平至实验结束;并逐渐出现多饮、多尿、多食、体重增长缓慢等DM症状，与NC组相比, 血糖、肾脏肥大指数均明显升高（表1、2）。

　　表1  两组大鼠血糖变化（略）

　　2.2  肾脏病理组织学改变

　　HE染色肾脏结构清楚，细胞核呈蓝色，胞浆呈粉红色。在整个实验过程中NC组大鼠的肾脏组织均未见明显病改变。第4周末，DM组大鼠肾小球体积略大于NC组，系膜区轻度增宽；第8周末，DM组肾小球系膜基质弥漫性增多, 系膜细胞明显增多, 肾间质、肾小管无明显病理形态学改变(图1A、B)。

　　2.3  肾组织EMMPRIN、MMP2的组织定位

　　免疫组化染色示EMMPRIN、MMP2抗原呈棕黄色或深棕黄色，主要表达在肾小球系膜细胞、内皮细胞、足细胞、 球囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞(图2、3)。

　　2.4  肾小球EMMPRIN、MMP2表达的变化

　　NC组大鼠在4、8 周末时肾小球MMP2、EMMPRIN无明显变化，DM组大鼠肾小球MMP2、EMMPRIN在4、

　　图1  大鼠肾组织病理表现  HE×400（略）
　　Fig 1  The kidney  of  rat  HE×400  A.Normal； B.Diabetic

　　图2  EMMPRIN在大鼠肾组织中的表达  PV二步法×400（略）
　　Fig 2  Expression of EMMPRIN in rat’s  kidney  ×400  C. Normal; D. Diabetic

　　图3  MMP2在大鼠肾组织中的表达  ×400（略）
　　Fig 3  Expression of  MMP2  in rat’s  kidney  ×400  E. Normal;F.Diabetic

　　8周末时均较NC组明显下降(P< 0. 05)；DM组大鼠在8周末时与4周末相比，肾小球MMP2下降(P<0.05)，
EMMPRIN明显下降(P<0.01) 。见表3。

　　3  讨论

　　本研究中SD大鼠进行单次腹腔注射STZ造模后72h血糖值均大于16.7 mmol・L-1,在实验过程中血糖值始终持续在(25.83±2.84) ～ (27.5±2.45) mmol・L-1的较高水平, 并且出现体重下降、多饮、多食、多尿和精神差等DM的典型临床表现。同时肾脏病理组织学检查证实, DM组出现肾小球系膜基质增多等DN早期的主要病理变化。以上均证实本实验中大鼠的病理组织学及病理生改变符合DN之变化。

　　表3  两组大鼠肾小球EMMPRIN、MMP2的表达（略）

　　ECM聚集过多是DN特征性的病理改变。本研究小组亦证实高糖促进肾细胞产生转化生长因子、结缔组织生长因子和Ⅳ型胶原增加［35］。正常情况下，机体精细调控肾脏ECM合成和降解的动态平衡。近来多数学者对DN发病机制的认识发生了改变, 先前认为ECM合成增加起重要作用,现在认为ECM的合成增加和降解减少并重,都可以促进肾小球的进行性硬化,甚至后者的作用更大［6］。ECM降解过程备受人们的重视。MMP2是肾脏ECM降解过程最关键性的酶之一，它属于明胶酶类Ⅳ型胶原酶，主要降解Ⅳ、Ⅴ型胶原以及明胶、纤连蛋白、弹性蛋白等。本实验结果显示DM鼠肾小球系膜基质增多，同时肾组织MMP2表达下调。

　　MMP2的表达受到很多因素的影响，如生长因子、细胞因子、理化刺激。近来有研究表明，新发现的因子EMMPRIN 可诱导MMP1、MMP2、MMP3在纤维母细胞上的表达［7］。EMMPRIN是一种相对分子质量约58000的跨膜糖蛋白,是免疫球蛋白超家族的成员之一,在肿瘤细胞的表面含量丰富［8］。Ellis等［9］首先从人类肺癌细胞LX1中提纯曾被称为肿瘤细胞起源的胶原酶刺激因子(tumour cellderived collagenase stimulatory factor, TCSF), 但后来研究发现它也同样存在于人类的正常组织,由于其能显著地诱导基质金属蛋白酶(MMPs)的产生, 所以Biswas等［10］于1995年将它重新命名为EMMPRIN。

　　目前，国内外对EMMPRIN的研究主要集中在肿瘤浸润和转移方面。EMMPRIN的主要功能是刺激人纤维母细胞上分泌MMPs , 特别是MMP1 、MMP2 和MMP3 的合成,促进ECM的降解,从而影响肿瘤的浸润和转移［4］。近来，PortikDobos等［11］发现DM患者动脉血管EMMPRIN 和MTMMP表达及MMP活性下降，降低的MMP促进了胶原沉积 、ECM积聚。本实验通过免疫组化的方法观察到EMMPRIN主要表达在正常大鼠肾小球系膜细胞、内皮细胞、足细胞、球囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞，与MMP2分布和表达水平完全一致，而DM时EMMPRIN和MMP2表达均显著下调，提示DM时，由于EMMPRIN降低下调MMP2的表达，从而增加了ECM沉积。

　　本实验通过大鼠DM模型初步证实EMMPRIN在DN时下调，提示其可能通过降低MMP2表达，增加肾小球ECM的聚集，促进DN的产生。目前关于EMMPRIN与DN的研究刚刚起步，由于EMMPRIN在调控MMPs及其ECM聚集方面属于早期事件，因此明确其功能及其调控机制对于深入研究DN发病机制以及开辟DN防治新途径具有十分重要的意义。

　　［］

　　［1］姜宗培,杨念生,韩东哲,等.基质金属蛋白酶及其组织抑制物在db/db小鼠糖尿病肾病中的表达和活性［J］.中山大学学报：医学版,2003,24(2):140142.

　　［2］YOUNG Y W, KWON H M, HWANG K C, et al. Upstream regulation of matrix metalloproteinase by EMMPRIN: extracellular matrix metalloproteinase inducer in advanced atherosclerotic plaque［J］. Atherosclerosis,2005, 180(1):3744.

　　［3］张彤,邓红,苏宁,等.茶多酚对高糖所致人肾系膜细胞活性氧产生的影响［J］.东南大学学报：医学版,2003,22（3）:151154.

　　［4］赵龙,邓红,汪颖南,等. 高糖、茶多酚对人系膜细胞结缔组织生长因子、纤维连接蛋白mRNA表达的影响［J］. 南京医科大学学报：科学版,2005,25(3):157160.

　　［5］汪颖南,邓红,苏宁,等. 氯沙坦对高糖培养的人系膜细胞血管内皮细胞生长因子表达的影响［J］.南京医科大学学报：自然科学版,2005,25(3):150153. 

　　［6］SONG Y,LI C,CAI L. Fluvastatin prevents nephropathy likely through suppression of connective tissue growth factormediated extracellular matrix accumulation［J］.  Exper Molec Pathol, 2004,76(1): 6675.

　　［7］GUO H,ZUCKER S,GORDON M K, et al.Stimulation of matrix metalloproteinase production by recombinant extracellular matrix metalloproteinase inducer from transfected Chinese hamster ovary cells［J］. J Biol Chem,1997,272(1):2427.

　　［8］SUZUKI S,SATO M,SENOO H, et al. Direct cellcell interaction enhances proMMP2 production and activation in coculture of laryngeal cancer cells and fibroblasts: involvement of EMMPRIN and MT1MMP［J］.Exper Cell Res,2004,293(2):259266.

　　［9］ELLIS S M,NABESHIMA K,BISWAS C. Monoclonal antibody preparation and purification of a tumor cell collagenase stimulatory factor［J］. Cancer Res，1989, 49(12): 33853391.

　　［10］BISWAS C,ZHANG Y,DECASTRO R, et al. The human tumor celldrived collagenase stimulatory factor(renamed EMMPRIN) is a member of the immunoglobulin superfamily［J］. Cancer Res,1995,55(2): 434439.

　　［11］PORTIKDOBOS V,ANSTADT M P, HUTCHINSON J, et al. Evidence  for a matrix metalloproteinase induction/activation system in arterial vasculature and decreased synthesis and activity in diabetes［J］. Diabetes,2002,51(10):30633068.