山西汉族类风湿关节炎与HLA-DPB1基因相关性研究初探

【摘要】  目的：探讨山西汉族类风湿关节炎（RA）与HLA-DPB1基因相关性。方法：用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法检测36例RA患者和36例健康人的HLA-DPB1基因型。结果：RA患者HLA-DPB1*2201等位基因的频率显著高于正常对照组。结论：HLA-DPB1*2201可能是山西汉族类风湿关节炎的易感基因。

【关键词】  类风湿关节炎；HLA-DPB1；PCR-SSP

    Abstract  Objictive：To investigate the association between HLA-DPB1 and rheumatoid arthritis(RA) of the Han nationality in Shanxi. Methods：polymerase chain reaction-sequence specific primers (PCR-SSP) was used to study the HLA-DPB1gene in 36 patients with RA and 36 healthy controls of the Han nationality in Shanxi. Results： The allele frequencies of HLA-DPB1*2201 was  significantly higher in RA patients than those in healthy controls. Conclusion：Our date suggested that the HLA-DPB1*2201 may be related to rheumatoid arthritis.

    key words  Rheumatoid arthritis;HLA-DPB1;PCR-SSP

    类风湿关节炎（RA）是一种严重影响人类健康的慢性自身免疫性疾病，国内外许多研究提示HLA-DPB1与RA的发病密切相关［1～6］。HLA-DPB1基因具有高度多态性，其分布可因人种、民族、地理环境等因素的不同而有很大差异，故不同地区、种族人群中与RA相关的HLA-DPB1基因型也存在较大差异。我们应用聚合酶链反应-序列特异性引物（PCR-SSP）方法，对RA患者和健康对照组的HLA-DPB1基因进行分型研究，以期为探讨RA的发病机制及遗传易感性提供。

    1  材料与方法

    1.1  研究对象

    2004年6月～2006年12月在长治医学院附属和济就诊的山西籍RA患者36例，均符合美国风湿病学会1987年制定的诊断标准；对照组36例为与患者同地区、无血缘关系的健康人。

    1.2  主要试剂

    HLA-DPB1分型PCR-SSP试剂盒为戴诺公司产品。

    1.3  基因组DNA制备

    无菌采集静脉血，分离外周血单个核细胞，采用改良的盐析法提取基因组DNA。提取的DNA用紫外分光光度仪测定浓度和纯度，OD260/280在1.7～1.9。

    1.4  PCR扩增

    将提取的基因组DNA作为模板与引物混合，加入dNTP及TaqDNA聚合酶，经PCR技术扩增基因片段。扩增条件为：第一步，96 ℃ 60 s；第二步，96 ℃ 25 s、70 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s共5个循环；第三步，90 ℃ 25 s、65 ℃ 50 s、72 ℃ 45 s共21个循环；第四步，96 ℃ 25 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 120 s共4个循环；4 ℃保温。PCR反应约1.5 h完成。

    1.5  基因型的确定

    取PCR扩增产物，2%琼脂糖凝胶（含0.5 μg/mL溴乙锭）电泳后，在紫外透射灯下观察结果，根据PCR产物的有无及大小确定基因型别。

    1.6  统计学处理

    所得结果用SPSS 10.0软件分析。RA患者和健康对照组各等位基因频率比较用四格表χ２双侧检验，显著性差异以P＜0.05为准。

    2  结果

    2.1.  HLA-DPB1分型结果

    RA患者及健康对照组HLA-DPB1等位基因分布见表1。

    张雄鹰等.山西汉族类风湿关节炎与HLA-DPB1基因相关性研究初探表1  RA患者和健康对照的HLA-DPB1基因频率比较* 与健康对照比较P＜0.05

    健康人中检出14种HLA-DPB1等位基因，其中HLA-DPB1*0201（22.2%）、HLA-DPB1*0501（22.2%）、 HLA-DPB1*0402（15.3%）、 HLA-DPB1*0301（9.7%）、 HLA-DPB1*2201（8.3%）基因频率较高。RA患者中检出9种HLA-DPB1等位基因，其中HLA-DPB1*2201（26.4%）、HLA-DPB1*0201（23.6%）、HLA-DPB1*0402（18.1%）、HLA-DPB1*0501（15.3%）、 HLA-DPB1*0301（6.9%）基因频率较高。

    2.2.  RA患者及健康人HLA-DPB1各等位基因比较

    结果显示RA患者的HLA-DPB1*2201基因频率显著低于健康人（P＜0.05）。

    3  讨论

    类风湿关节炎（RA）是一种严重影响人类健康的慢性自身免疫性疾病，严重影响患者的生活质量和工作能力。其发生与遗传、免疫、感染、内分泌及环境因素有关，但确切病因尚未阐明。

    HLA-Ⅱ类分子是由α链和β链组成的异二聚体糖蛋白分子，与器官移植、自身免疫性疾病等的临床表现及预后密切相关［７］。HLA-Ⅱ类分子具有高度的多态性，HLA型别在不同的人种和民族中分布的频率不同，我国汉族包括华南和华北两大群体［８］，疾病与HLA的相关情况在不同人种和民族中有所差异。经典的HLA-Ⅱ类分子包括DR抗原、DQ抗原和DP抗原。DP抗原的α链和β链分别由第六号染色体的DPA1和DPB1基因编码，其中的DPB1具有高度多态性。我们应用PCR-SSP基因分型方法对36例山西汉族健康人进行了HLA-DPB1基因分型，检出14种HLA-DPB1等位基因，其中HLA-DPB1*0201(22.2%)、HLA-DPB1*0501(22.2%)、HLA-DPB1*0402(15.3%)、HLA-DPB1*0301(9.7%)、HLA-DPB1*2201(8.3%)基因频率较高。初步探讨了山西汉族HLA-DPB1基因的多态性，以期为今后深入探讨山西汉族的免疫遗传特征提供参考。

    近年，DPB1与自身免疫病的相关性以成为人们关注的热点之一。大量报道青少年类风湿关节炎与HLA-DPB1*0201相关［１］。研究表明HLA-DPB1*0401、HLA-DPB1*0201、HLA-DPB1*0601等等位基因与白种人类风湿关节炎相关［２～5］。Yen JH等研究发现人的RA可能与HLA-DPB1等位基因不相关［９］。朱乃硕等研究结果显示上海地区RA患者HLA-DPB1*1601、HLA-DPB1*2201频率显著高于正常人，而正常人HLA-DPB1*0501频率显著高于RA患者［６］。但未见有关中国北方汉族RA与DP基因相关性的研究报道。本研究比较山西汉族正常人及RA患者HLA-DPB1等位基因频率，结果显示，HLA-DPB1*2201等位基因在RA患者中的分布频率显著高于正常人，提示HLA-DPB1*2201可能是山西汉族RA的易感基因，希望本研究能对进一步探讨类风湿关节炎的发病机制提供有用的帮助。

【参考文献】
  ［１］ Murray KJ,Moroldo MB,Donnelly P,et al.Age-specific effects of juvenile rheumatoid arthritis-associated HLA alleles. Arthritis Rheum.1999，42(9):1　843～１　８53．

［２］ Perdriger A,Semana G,Quillivic F.DPB1 polymorphism in rheumatoid arthritis: evidence of an association with allele DPB1*0401.Tissue Antigens，1992，39:14～１8．

［３］ Tsuckiya K,Kimura A,Kindo M,et al.Combination of HLA-Aand HLA class Ⅱ alleles controls the susceptibility to rheumatoid arthritis. Tissue Antigens，2001，58(6):395～401．

［４］ Seidl C,Koch U,Brunnler G,et al.HLA-DR/DQ/DP interactions in rheumatoid arthritis. Eur J Immunogenet.1997，24(5):365～３76．

［５］ Perdriger A,Guggenbuhl P,Chales G,et al.The role of HLA-DR-DR and HLA-DR-DP interactions in genetic susceptibility to rheumatoid arthritis.Hum Immunol.1996，46(1):42～４8．

［６］ 朱乃硕，王福庆，陈诗书，等.上海地区汉族正常人和类风湿关节炎病人HLA-DPB1基因多态性分析.中国免疫学杂志，2000，16（4）：196～１９7．

［７］ Turesson C.Endothelial expression of MHC class Ⅱmolecules in autoimmune disease.Curr Pharm Des.2004，10(2):129～１43．

［８］ 陈仁彪，叶根跃，庚镇成，等.我国大陆少数民族HLA多态性聚类分析和频率分布对中华民族起源的启示.遗传学报，1993，20（5）：389～398．

［９］ Yen JH,Chen JR,Tsai WJ,et al.HLA-DPB1 polymorphism in patients with rheumatoid arthritis in Taiwan.J Rheumatol，1995，22(11):2 034～2 037.

    2  结果

    2.1.  HLA-DPB1分型结果

    RA患者及健康对照组HLA-DPB1等位基因分布见表1。

    张雄鹰等.山西汉族类风湿关节炎与HLA-DPB1基因相关性研究初探表1  RA患者和健康对照的HLA-DPB1基因频率比较* 与健康对照比较P＜0.05

    健康人中检出14种HLA-DPB1等位基因，其中HLA-DPB1*0201（22.2%）、HLA-DPB1*0501（22.2%）、 HLA-DPB1*0402（15.3%）、 HLA-DPB1*0301（9.7%）、 HLA-DPB1*2201（8.3%）基因频率较高。RA患者中检出9种HLA-DPB1等位基因，其中HLA-DPB1*2201（26.4%）、HLA-DPB1*0201（23.6%）、HLA-DPB1*0402（18.1%）、HLA-DPB1*0501（15.3%）、 HLA-DPB1*0301（6.9%）基因频率较高。

    2.2.  RA患者及健康人HLA-DPB1各等位基因比较

    结果显示RA患者的HLA-DPB1*2201基因频率显著低于健康人（P＜0.05）。

    3  讨论

    类风湿关节炎（RA）是一种严重影响人类健康的慢性自身免疫性疾病，严重影响患者的生活质量和工作能力。其发生与遗传、免疫、感染、内分泌及环境因素有关，但确切病因尚未阐明。

    HLA-Ⅱ类分子是由α链和β链组成的异二聚体糖蛋白分子，与器官移植、自身免疫性疾病等的临床表现及预后密切相关［７］。HLA-Ⅱ类分子具有高度的多态性，HLA型别在不同的人种和民族中分布的频率不同，我国汉族包括华南和华北两大群体［８］，疾病与HLA的相关情况在不同人种和民族中有所差异。经典的HLA-Ⅱ类分子包括DR抗原、DQ抗原和DP抗原。DP抗原的α链和β链分别由第六号染色体的DPA1和DPB1基因编码，其中的DPB1具有高度多态性。我们应用PCR-SSP基因分型方法对36例山西汉族健康人进行了HLA-DPB1基因分型，检出14种HLA-DPB1等位基因，其中HLA-DPB1*0201(22.2%)、HLA-DPB1*0501(22.2%)、HLA-DPB1*0402(15.3%)、HLA-DPB1*0301(9.7%)、HLA-DPB1*2201(8.3%)基因频率较高。初步探讨了山西汉族HLA-DPB1基因的多态性，以期为今后深入探讨山西汉族的免疫遗传特征提供。

    近年，DPB1与自身免疫病的相关性以成为人们关注的热点之一。大量报道青少年类风湿关节炎与HLA-DPB1*0201相关［１］。研究表明HLA-DPB1*0401、HLA-DPB1*0201、HLA-DPB1*0601等等位基因与白种人类风湿关节炎相关［２～5］。Yen JH等研究发现人的RA可能与HLA-DPB1等位基因不相关［９］。朱乃硕等研究结果显示上海地区RA患者HLA-DPB1*1601、HLA-DPB1*2201频率显著高于正常人，而正常人HLA-DPB1*0501频率显著高于RA患者［６］。但未见有关中国北方汉族RA与DP基因相关性的研究报道。本研究比较山西汉族正常人及RA患者HLA-DPB1等位基因频率，结果显示，HLA-DPB1*2201等位基因在RA患者中的分布频率显著高于正常人，提示HLA-DPB1*2201可能是山西汉族RA的易感基因，希望本研究能对进一步探讨类风湿关节炎的发病机制提供有用的帮助。

【参考文献】
  ［１］ Murray KJ,Moroldo MB,Donnelly P,et al.Age-specific effects of juvenile rheumatoid arthritis-associated HLA alleles. Arthritis Rheum.1999，42(9):1　843～１　８53．

［２］ Perdriger A,Semana G,Quillivic F.DPB1 polymorphism in rheumatoid arthritis: evidence of an association with allele DPB1*0401.Tissue Antigens，1992，39:14～１8．

［３］ Tsuckiya K,Kimura A,Kindo M,et al.Combination of HLA-Aand HLA class Ⅱ alleles controls the susceptibility to rheumatoid arthritis. Tissue Antigens，2001，58(6):395～401．

［４］ Seidl C,Koch U,Brunnler G,et al.HLA-DR/DQ/DP interactions in rheumatoid arthritis. Eur J Immunogenet.1997，24(5):365～３76．

［５］ Perdriger A,Guggenbuhl P,Chales G,et al.The role of HLA-DR-DR and HLA-DR-DP interactions in genetic susceptibility to rheumatoid arthritis.Hum Immunol.1996，46(1):42～４8．

［６］ 朱乃硕，王福庆，陈诗书，等.上海地区汉族正常人和类风湿关节炎病人HLA-DPB1基因多态性分析.中国免疫学杂志，2000，16（4）：196～１９7．

［７］ Turesson C.Endothelial expression of MHC class Ⅱmolecules in autoimmune disease.Curr Pharm Des.2004，10(2):129～１43．

［８］ 陈仁彪，叶根跃，庚镇成，等.我国大陆少数民族HLA多态性聚类分析和频率分布对中华民族起源的启示.遗传学报，1993，20（5）：389～398．

［９］ Yen JH,Chen JR,Tsai WJ,et al.HLA-DPB1 polymorphism in patients with rheumatoid arthritis in Taiwan.J Rheumatol，1995，22(11):2 034～2 037.